1、高转换型肾性骨病中骨保护素及其配体的表达和形态计量学观察中华肾脏病杂志 2006 年 2 月第 22 卷第期 hi!P!高转换型肾性骨病中骨保护素及其配体的表达和形态计量学观察钱莹陈楠朱萍汪关煜王伟铭李娅冯伟【摘要】目的观察高转换型肾性骨病中骨保护素及其配体(OPG,RANKL) 的表达,并与骨形态计量学指标进行相关分析.方法选择 10 例慢性肾衰尿毒症患者和 3 例正常人进行髂骨活检术,获得骨组织标本.采用免疫组化方法检测 OPG 和 RANKL 蛋白质的表达.采用全自动图像分析系统进行骨组织形态计量学测定.结果 10 例慢性肾衰尿毒症患者经骨病理学检查证实均为高转换型骨病,以破骨细胞活化形
2、成骨吸收陷窝伴或不伴骨矿化不全为特点.免疫组化显示尿毒症患者骨组织中以 RANKL 阳性表达为主.与正常对照相比,RANKL 阳性表达细胞数目显着增加,OPG 阳性表达细胞数目显着减少 .尿毒症患者 RANKL 的阳性表达细胞数目与骨吸收面积和破骨细胞数目呈显着正相关.结论高转换型肾性骨病中,PTH 的溶骨作用可能是通过 OPG/RANKL/RANK 系统介导的.【关键词】尿毒症;甲状旁腺激素;高转换型骨病;骨保护素; 骨保护素配体Expressionofosteoprotegerinandosteoprotegerinligandinhighturnoverbonediseeandhisto
3、morphometricanalysisofbonetissueQIANYing,CHENNan,ZHU,WANGGuanyu,WANGWeiruing,LIYa,FENGWei,DepartmentofNephrology,RuijinHospital,ShanghaiJiaotongUniversuy,.sn200025,ChinaCorrespondingautho:CHENNan.Email:【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionofosteoprotegerin(OPG)andosteoprotegerinligand(RANKL)
4、inhighturnoverrenalbonediseaseandstudythecorrelationbetweenimmunohistochemistryandhistomorphometricmeasurementsofbone.MethodsBonebiopsywasperformedontenchronicrenalfailure(CRF)patientsandthreenormalpersons.BonetissueswerestudiedforOPGandRANKLexpressionbyimmunohistochemistryandhistomorphometricmeasur
5、ementusinganautomaticimageanalysissystem.ResultsTenuremicpatientswerefoundtohavehighturnoverbonediseaseaccordingtothebonehistology.AsignificantlyincreasingtendencyofRANKLpositiveceilsandasignitlcanflyreducingtendencyofOPGpositiveceilswereobservedinCRFpatientscomparedwithcontrolsuects.Histomorphometr
6、icanalysisshowingthatthenumberofRANKLpositiveceilswassigniticanflycorrelatedwithhistologicallyincreasingboneresorbtion(bothboneresorbtionsurfaceandnumberofosteoclasts)inuremicpatients.ConclusionOPG/RANKL/RANKsystemisinvolvedinhighturnoverrenalbonediseasebyparathyroidhormone.【Keywords】 Uremia;Parathy
7、roidhormone;Highturnoverbonedisease;Osteoprotegerin;Osteoprotegerinligand根据骨病理,.肾性骨病(ROD)分为高转换型,低转换型和混合型.高转换型.肾性骨病(predominanthyperparathyroidbonedisease,PHBD)的主要原因是继发性甲旁亢,其破骨细胞异常增作者单位:200025 上海交通大学附属瑞金医院肾内科通信作者:陈楠,Emial:.临床研究.生活跃,在骨小梁表面形成骨吸收陷窝或囊腔是其主要的病理特征之一.成骨细胞与破骨细胞之间信息交流的分子基础是骨保护素及其配体和 NFKB 的活化受体
8、,即 OPG/RANKL/RANK 系统,且甲状旁腺激素(PTH)对该系统有调控作用1-2. 在以骨吸收为主要表现的疾病中,如多发性骨髓瘤,骨质疏松,类风湿性关节炎等骨组织中均见 OPG 或中华肾脏病杂志 2006 年 2 月第 22 卷笠 2 期 in!P!:!:!:RANKL 蛋白质的表达,且以 RANKL 表达为主.在尿毒症肾性骨病中,尤其是 PHBD 中,OPG 和RANKL 蛋白质的表达情况如何,尚未检索到有关报道.本研究的目的是通过对慢性肾衰尿毒症患者进行骨活检,了解 OPG 和 RANKL 在慢性肾衰尿毒症 PHBD 骨组织中表达的情况 ,从而探讨OPG/RANKL 系统与 PH
9、BD 的关系.对象与方法一,研究对象10 例慢性肾功能衰竭尿毒症患者,男 8 例,女 2 例,平均年龄(53.411.8)岁,平均透析时问为(21.2_+40) 月,其中血透 8 例,腹透 2 例.原发病因为慢性肾小球肾炎 4 例.痛风肾 2 例,糖尿病肾病,IgA 肾病,紫癜性肾炎,高血压,肾动脉硬化各1 例.正常对照 3 例,均为男性,平均年龄(55.310.6)岁 .二,研究方法1.骨活检:骨活检的对象符合以下条件:(1)确诊为慢性肾功能衰竭尿毒症,Ccr10ml/min:(2)年龄 18 70 岁;(3) 无长期服用糖皮质激素及雌激素史;(4) 血 PTH正常上限的 5 倍以上;(5)
10、排除多发性骨髓瘤及其它骨肿瘤.上述所有尿毒症患者均行髂前上棘骨活检术.患者在严格消毒与局麻下,切开皮肤,分离软组织直至骨膜,并采用特殊加工的骨钻垂直刺入骨组织约 2cm 以上,轻轻摇动折断基部,拔针后用针芯将所取骨组织(直径 5mm,长约 1.52cm)推入盛有甲醛的小瓶中固定备用.正常对照取材髂前上棘骨活检标本.骨活检前常规四环素骨标记(150mg.tidx3d,2 周后,150mg,tidx3d,3d 后行骨活检).2.不脱钙骨组织的处理和染色:将骨标本置于甲基丙烯酸甲酯中浸透,放入真空干燥器内的冰浴中,并以 YQO2.30 型 30 升旋片式真空泵抽真空,冰浴浸透 1h.德国 Leica
11、 公司的 ReichertYung 重型切片机连续切片,切片厚 5m.进行甲苯氨蓝染色和 Masson 染色.3.脱钙骨组织的处理和染色:10%EDTA(乙二胺四乙酸二钠)脱钙 34 周.取出标本置于DXIS 公司的 LX120TissueProcessor 自动脱水机中脱水,透明,透腊 24h,置于 Leica 公司的 EG1140H 自动包埋机中包埋,4C 冰箱保存 12h.取出标本在 Leica 公司的 RM2135 切片机连续切片,切片厚 3m.常规 HE 染色.3.OPG 和 RANKL 免疫组化:骨组织石蜡切片厚约 3m,常规 60cc 烤片 2h,二甲苯脱蜡 45min(2 次)
12、,梯度酒精脱水.玻片置 3%过氧化氢(HO)缓冲液中 10min,以灭活内源性过氧化物酶,抗原修复 110min.正常山羊血清封闭,置室温 20min.兔抗人 OPG 多抗 (美国 Chemieon,AB2125P),浓度 1:60;兔抗人 RANKL 多抗(美国Chemieon,AB1862),浓度 1:300,4孵育过夜.生物素标记的山羊抗兔 IgG,室温孵育 60rain.SABC 室温孵育 45min,DABH2O2 显色 5rain,苏木素复染细胞核 1rain.阴性对照采用 PBS 替代一抗,其余步骤相同,结果均为阴性.5.骨组织学形态计量分析:将染色的不脱钙骨切片标本置于德国 L
13、eiea 的 QW550 全自动图像分析系统上,行骨组织形态计量学测定,每张切片随机选择 5 个视野,测定的参数如下:(1)骨形成参数:包括类骨质厚度,类骨质表面积和成骨细胞表面积.(2)骨吸收参数 :包括骨吸收表面积 ,骨陷窝深度和破骨细胞数.(3) 骨动力学指标:骨形成率和矿化率.(4)OPG,RANKL 阳性细胞计数.6.统计学分析:所有参数以s 表示.应用SPSS11.0 统计软件处理数据.骨组织形态计量学指标与外周血生化指标和免疫组化指标进行Pearson 相关分析 .两组资料采用 Wileoxon 成组检验.结果一,慢性肾衰尿毒症患者临床资料10 例尿毒症患者血肌酐水平为(1181
14、_+468)Ixmol/L,血 iPTH 水平为(780_+498)pg/min.血钙为(1.98 0.27)mmol/L,血磷为 (1.930.58)mmol/L,血 CO2CP 为(21.30.89)mmol/L,血碱性磷酸酶为(83.7+33.3)mmol/L,血红蛋白为(71.317.3)g/L,血浆白蛋白为(29.25.41)g/L. 根据临床表现,骨病理改变和骨动力指标确定诊断.10例患者均为 PHBD,以骨病理中见多个骨吸收陷窝伴或不伴类骨质增加为主要特点,同时骨形成和矿化率增高.7/10 例表现为不同部位的骨痛.其中,胸,背部疼痛 3 例,占 42.9%;双下肢疼痛 3例,占
15、42.9%;全身骨痛 1 例,占 14.3%.疼痛频度为经常性 3 例,占 42.9%;其余为偶尔发作.占57.1%IHlid 患骨 LI 包讹乜举 I 雠色 IllJ 的日 lr,k【t窝离巾可化的 i 茈啦破骨细咆虬I商 l 他们细精JfII:x2011.n.Jl 州抛 fq,霍临 x2(m)目 11-HlDl_1J 竹 u也【骨锕 I/l?-i 川 f学观察If 骨刊心绢扪_I:.PIIBu 的阿肜战奎触及目嘁收磬数均!普增加.是 I,表 2表 I 雌 r1 患 n0 汁川指标i表 2 恺联盎脯患忏的曲 J.学措标四,而组骨组织中 OPG 和 ItANKL 的表达PHBD 患者的月纽织中
16、均可见 RANKL 的阳性表达.主要表达在骨小边缘的成熟成骨细胞和部分未活化的成骨细胞.见图 2 所有高转换型骨病标水巾仅 2 例岘 OPC 的 W性表达正常利蛸组以 OPG 阳性表逃为主,见图 2,仪 l 例有RANKL 阳性表达.尿毒症患者以 IIANKL 阳性表达细胞为主.与谁常对照蝴相比.显着增加 f(8559)比(2259)个/mm,P=0018 而 OPC 阳性表达细胞与正常对照组相比.显着减少(5752)比(】1352) 个/ram.P=O0l611IIBI)患者外周 m 生化指标与骨形态计量?/.1.,:1,HH1息打 R 缒,HAhKIJ,罐山埠熟膻慨PIID竹 t|ItK
17、土】土表都舡 1 柏啦措细m:I 睢1ll灶止 Iin.H4船去世 fm学指际的州是一扪是分忻显.寓腰(骨啦 t 厚度)与钙雠乘积旱菩 II 柑咒(r=(1072.t005:KP 旱昔负 1l=j 咒(r=-O632.,(0【l5):娄骨质厚 0FI 量 If 水平业酱鱼扣一 0683./,(005)六 l,IIIjn 息 J 惫 Il 量学指标 jOPC 和lANKI 川悱襄达的栅 X 性柯戈分析.骨啦收表面积与 RAKJm 性川胞敬 菩【l 一州共(r=0780.尸0【lI):破月敬 HRNKI.I|ut 细乜数蔷止棚关(r=0878.P00I):破习胞数目与 OI,C 竹细胞数亦苷的 J
18、L 十 H 关r=0722P( 【J05)进凡尿毒症期时.儿乎 1【M1 患肯胤nflJ无绝 m 谴或胆透患者轻型 H9 似存发.发生卒为 23%列求进入透析的雕毒症患者,I1(】I)的发率尚逃 62%,【 lI 以九,J发病半最高占 23%混台骨病 10iI8 坼.化l2 坼 HTml9l 各求报遵结,一的娘 f 可能与所选出青病病情轻蕈一墟爿活柠莳的淆疗情,等相是在瓤匝札拄时.爵活舱提 IIOD 伴继蹙忭骨皿疏松 HD 以高-止瞥的目呼化艘胞活化.局肾帔收增J .,:.0中华肾脏病杂志 2006 年 2 月第 22 卷箜塑!P:Q:!丝:!:为主要特征;晚期纤维化的骨占优势甚至完全替代了骨
19、髓,故 PHBD 又称为纤维囊性骨病 .本研究中 10 例尿毒症患者形态计量学资料及骨活检病理均证实为 PHBD,且临床大多表现为骨痛 ,与报道相同.由于 ROD 的诊断需要骨活检,为有创性,患者难以接受.非侵入性指标包括骨源性碱性磷酸酶(B.AKP),I 型胶原前肽(PICP),骨钙素(BGP)等.但均不能达到理想的诊断效果.外周血 iPTH水平可大致估计 ROD 的类型.由于 OPG 表达的高低直接影响破骨细胞的活化程度和 ROD 的分型.因此.国外近年来 ROD 的研究开始涉及OPG/RANKL/RANK 系统.近年来研究结果提示,血透患者外周血 OPG 水平升高,血 OPG 与成骨细胞
20、和破骨细胞表面积呈负相关.并与骨密度和骨陷窝表面积呈负相关,提示 OPG 参与肾性骨病的分型.且可独立预测骨密度8.PHBD 时外周血OPG 水平显着低于 LTBD.提示 PTH 抑制 OPG 表达,促进破骨细胞活化,与体外研究结果相同.但亦有报道,PHBD 时外周血 OPG 水平显着高于LTBD,作者的解释为在 PHBD 中,PTH 刺激成骨细胞增殖,因此成骨细胞大量表达 OPG 及其它成骨细胞指标,但同时发现 OPG 与 iPTH 呈负相关,当 iPTH1000pg/ml 时,这种负相关关系消失,因此 iPTH 升高亦可导致 OPG 水平升高均.本研究首次用骨组织免疫组化的方法,直接显示慢
21、性肾衰尿毒症 PHBD 骨组织中 OPG 和RANKL 有阳性表达,且与正常对照相比,RANKL阳性细胞数目显着增高,而 OPG 阳性细胞数目显着下降.结果提示.RANKL 能促进破骨前体细胞分化为成熟的破骨细胞,并促进其活化,从而导致骨的吸收增加.另一方面,OPG 减少.使抑制破骨细胞活化的作用减弱.本研究中.RANKL 阳性细胞数目与骨吸收面积和破骨细胞数目呈显着的正相关,进一步证实 OPG 和 RANKL 可能参与了慢性肾衰尿毒症 PHBD 发生和发展 .但本研究中尚发现 OPG 阳性表达细胞数目与破骨细胞数目呈显着的正相关,尽管显着性较 RANKL 阳性表达细胞差,但理论上较难解释,可
22、能的原因是仅有的 2 例 OPG 阳性表达者同时 RANKL 阳性高表达导致破骨细胞活跃.本研究中还发现外周血指标中.与骨病理关系较密切的指标有 CaxP,AKP和 Alb.与报道相符9-.我们首次报道 OPG 和RANKL 在 ROD 中有阳性表达及表达情况,并进一步与骨组织形态计量学指标进行相关分析,发现了有意义的结论,为今后进一步在临床诊断方面推广应用并用于治疗提供了一定的理论根据.参考文献1KhoslaS.Minireview:theOPG/RANKL/RANKsystem.Endocrinology,2001,142:50505055.2SeekT,DielI,BismarH,eta
23、1.Serumparathyroidhormone,butnotmenopausalstatus,isassociatedwi 山山 eexpressionofosteoprotegerinandRANKLmRNAinhuman.bonesamples.EurJEndocrinol,2001,145:199205.3HoLT,SpragueSM.Renalosteedystrophyinchronicrenalfailure.SeminNephrol,2002,22:488?493.4SpIasovskiGB,BervoetsAR,BehetsGJ,eta1.Spectrumofrenalbonediseaseinendstagerenalfailurepatientsnotyetondialysis.NephrolDialTransplant,2003,18:1159?1166.
