1、基因表达检测的最终技术目标是能确定所关注的任何组织、细胞的 RNA 的绝对表达量。可以先从样本中抽提 RNA，再标记RNA，然后将这些标记物作探针与芯片杂交，就可得出原始样本中不同 RNA 的量。然而用于杂交的某个特定基因的 RNA 的量与在一个相应杂交反应中的信号强度之间的关系十分复杂，它取决于多种因素，包括标记方法、杂交条件、目的基因的特征和序列。所以芯片的方法最好用于检验两个或多个样本中的某种 RNA 的相对表达量。样本之间某个基因表达的差异性（包括表达的时间、空间特性及受干扰时的改变）是基因表达最重要的，而了解 RNA 的绝对表达丰度只为进一步的应用或多或少地起一些作用。基因表达的检测
2、有几种方法。经典的方法（仍然重要）是根据在细胞或生物体中所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一特定基因是否表达。随着大分子分离技术的进步使得特异的基因产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。随着重组 DNA 技术的运用，现在有可能检测分析任何基因的转录产物。目前有好几种方法广泛应用于于研究特定 RNA 分子。这些方法包括原位杂交NORTHERN 凝胶分析打点或印迹打点S1 核酸酶分析和 RNA 酶保护研究。这里描述 RT-PCR 从 RNA 水平上检查基因表达的应用。 8 f3 f- |2 L) K) b7 - - |RT-PCR 检测基因表达的问题讨论关于 RT-PCR 技术方法的描述参见 P
3、CR 技术应用进展，在此主要讨论它在应用中的问题。理论上 1L 细胞质总 RNA对稀有 mRNA 扩增是足够了（每个细胞有 1 个或几个拷贝） 。1L 差不多相当于 50100，000 个典型哺乳动物细胞的细胞质中所含 RNA 的数量，靶分子的数量通常大于 50，000，因此扩增是很容易的。该方法所能检测的最低靶分子的数量可能与通常的 DNAPCR 相同；例如它能检测出单个 RNA 分子。当已知量的转录 RNA（用 T7RNA 聚合酶体外合成）经一系列稀释，实验结果表明通过 PCR 的方法可检测出 10 个分子或低于 10 个分子，这是反映其灵敏度的一个实例。用此技术现已从不到 1个 phil
4、adelphia 染色体阳性细胞株 K562 中检测到了白血病特异的 MRNA 的转录子。因此没必要分离 polyA+RNA，RNA/PCR法有足够的灵敏度来满足绝大多数实验条件的需要。7 H+ F例如: 一份 cDNA 反应物可用于研究几种不同类型的 RNA。cDNA反应物通常用 PCR 缓冲液衡释 5 倍。将 cDNA 的浓度隆低至0.2mM，此浓度更适于 Taq 聚合酶。dNTP 浓度不应超过0.2mM，因为较高浓度的 dDTP 使 Taq 聚合酶的错误掺入或突变率增高。对于扩增来说，即使 dNTP 的浓度低到 0.05mM 也不会出现问题。 R7 z) H u1 ( 镁离子浓度对反应十
5、分重要，因此应注意将镁的摩尔浓度保持恒定。有时核酸溶于含 1mMEDTA 的缓冲液中，EDTA 可歼螯合大多数镁离子。通常，PCR 反应中游离镁离子浓度应保持在 2mM。将 PCRA 循环次数减少，不可避免地产生许多非特异性的扩增产物。很容易将长度不同的 DNA 的扩增。即使基因组序列得到扩增，当引物与大小不同的外显子结合时，很容易将长度不同的 MRNA 与基因组的产物区别一来。如果不了解基因组的结构，选用与 5“编码基因间隔 300-400bp 的引物，脊椎动物的外显子很少大于 300-400bp，因此很容易从不同的外显子中导出引物。如果所研究的基因无内含子、或者研究完整原病毒RNA 转录，
6、为了获得有关 PCR 的结果有必要用 DNA 酶彻底处理 RNA。只要有很少量的基因组 DNA 污染，用此方法分析就会出现假阳性结果。9 9 o- ( v; U N# % r$ h9 |- L1 i7 ( _+ - h实际应用举例 / W“ 1 T. m$ P0 F$ M+ x基因表达检测8 p. z L9 A G7 J“ Q c8 q7 X用该方法先后扩增，检测了许多不同类型的细胞、组织和器官的 mRNA。当然，仅仅检测 mRNA 并没有新颖之处，它的新颖在于能对 10-1000 个细胞的 RNA 进行分析。所需起始物质比通常的低很多，这使得研究者能设计并进行以前看是不可能进行的实验。例如研
7、究血细胞生成的研究人员经常用群体分析确定生长因子或环境对特殊细胞系发育的影响。经常部到的一个问题是:群体细胞产生的何种生长/ 分化因子会影响其本身的发育。现在可以确信，利用 RNA/PCR 技术能够对数百个群体的 mRNA 对任何与生长或分化有关的因子进行分析。而用常规的杂交或抗体检测方法来分析它们是极其因难、甚至是不可能的。RNA/PCR 技术在研究转基因动物方面将非常有用。我们常常不仅要知道在动物体内转移的基因是否表达，而且要知道是在哪些细胞组织或器官中表达。随着 RNA/PCR 检测灵敏度的提高，能够检测转基因动物的多个部位而不必为取样而将它处死。我们还可以列举许多这样的例子，但我们留给
8、读者一些有关检测方面的设想。4 $ i k2 N2 N, s( q用于诊断的 RNA 序列的扩增 n. u6 Y g在下面将列举数个 RNA/PCR 扩增方法的主要应用。首先是对鼠鸟氨酸氨甲栈基转移酶 mRNA 进行亚克隆来确定缺失点突变的位置。同样，该方法可用于检测哺乳动物细胞 mRNA 转录后的剪接，研究与 HLA 疾病相关性因素，分析人 HPRT 突变，研究自身免疫与 T 细胞受体序列之间的关系，分析人碱性磷酸脂酶的突变，研究土拨鼠肝炎病毒引发的 c-myc 活性，确定刺桐丁蛋白 4.1mRNA 的剪接变异，等等。 6 p/ l$ I6 5 W E5 ; U9 a$ 根据已发表的序列合成
9、扩增 mRNA 的引物，我们发现用RNA/PCR 是获取 cDNA 的最简便的方法。用在 5“末端带有限制性内切酶位点的引物来扩增 mRNA 的一部分或全部编码区域。扩增后，PCR 产物经合适的酶切并与适于表达的载体连接或制备成探针。按此方法可在一星期内完成从 RNA 样品到用于高效表达的修饰 cDNA 克隆.这比常规的合成/筛选 cDNA 库，亚克隆靶 cDNA，为达到表达目的而对克隆进行诱变等过程要简单得多。区别主要在于用于扩增和分离 cDNA 克隆的引物为简并引物。引物序列是根据氨基酸的序列而定的，因此当只知道很少的蛋白质序列时，就有可能扩增特异的 RNA 分子。当只知一个内部序列时，只用一个基因特异性寡核苷酸引物，也可用PCR 从稀有 mRNA 中分离出 cDNA。扩增 cDNA 的分析因使用本书其它章切有关 PCR 产物的直接序列分析步骤而变得简单。将噬菌体(T7)启动了作为 PCR 引物的一部分同样可用于序列分析，因为 PCR 终产物中有大量的群体特异的产物。
