1、高级生物化学,第一章 聚糖化学朱永宁编辑,本章目录,1.1 糖生物学 1.2 寡糖的研究 1.3 多糖的研究 1.3.1 均一多糖 1.3.2 不均一多糖 1.4 复合多糖 1.5 多糖的分离纯化 1.6 多糖的含量测定,高级生物化学,糖知识回忆,糖类物质多羟基醛或酮的化合物、聚合物或衍生物。根据分子大小分类单糖、寡糖、多糖； 根据组成分类均一多糖、杂多糖、 糖蛋白、糖脂等。,高级生物化学,1.1 糖生物学,1988年，牛津大学生化系的德韦克在生化年评上,提出了“糖生物学”(Glycobiology)概念,并发表了题为糖生物学的综述。,高级生物化学,糖链的多样性和复杂性,4 种核苷酸每3个一组
2、，可组成：43 = 64 个三联体密码 而4种己糖则可组成：3万多种寡糖链。所以，糖链结构具有极端复杂的特性 糖链信息量大：糖链所包含的信息量远远大于核酸和蛋白质（甚至大几个数量级）,高级生物化学,活性多聚糖：如：血管内皮细胞白细胞黏附分子（E-选择蛋白），能识别白细胞表面SLex抗原(四聚糖表面抗原）。 当组织受损或感染时，白细胞通过其表面SLex抗原黏附于血管内皮细胞表面的白细胞黏附分子上进入受损组织，进而杀灭入侵病原体。 但过多的白细胞聚集，会引起炎症及类风湿等自身免疫性疾病。,高级生物化学,美籍华裔科学家王启辉首先用酶法合成了SLex（4聚糖表面抗原)； 之前的推算价格：20亿美元/千
3、克。经他合成后，价格降低了34个数量级，并已由凯特尔(Cytel)公司生产。此后，格力斯迈德(Glycomed)公司从甘草中，发现了SLex类似物-甘草素，可识别E-选择蛋白，因此封闭血管内皮细胞表面的E-选择蛋白，因而可抑制白细胞聚集，从而达到抗炎的目的。,高级生物化学,1.1.1 多糖 (polysaccharides,PS),多聚糖广泛地存在于动物、高等植物、微生物(细菌和真菌)及海藻等机体中。 多糖的生物活性、功能及特点：复杂、多样 例如： 广谱免疫促进剂，具有免疫调节功能如：可治疗风湿病、病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病；能抗爱滋病病毒；具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂等疗效
4、；,高级生物化学, 促进核酸与蛋白质的生物合成可控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老； 毒性较低我国对多糖的活性功能研究起步较晚，但近十几年来取得了较大进展，有大量活性多糖被发现，并证实均具有广泛的生物功能。,高级生物化学,研究发现： 多糖活性与其结构密切相关,相关因素： 与单糖种类、糖苷键的类型有关； 与多糖的取代基，特别是硫酸基的取代度与取代位置有关； 与多糖的空间结构有关； 与多糖的分子量大小有关；,高级生物化学,多糖缺点：分子量大，粘度大，溶解扩散困难，结构复杂，因此，吸收困难，应用受限。寡糖优点：分子量小，结构简单，溶解性增强，低毒性，因此，稳定性和安全性较好。许多多糖链经断裂后
5、，可使活性提高，寡糖的低毒性是多糖与其他天然活性物质所不能比拟的，因此，对寡糖的研究日益受到重视。,高级生物化学,对海洋生物活性物质的开发利用，是近30年发展起来的。 海洋的独特环境造就了众多具有特异性功能的活性物质。多糖在其中占有重要地位。海藻多糖由于其在海藻中的含量高，原料来源丰富且有保障，药理作用显著，毒副作用小，成为当前海洋药物开发的热点。 通过对海藻多糖的结构及生物活性的研究，目前已开发出多种多糖类药物。,高级生物化学,1.2 寡 糖,寡糖(oligosaccharide)由2-20个单糖分子通过糖苷键连接而成的化合物，它广泛存在于生命体内； 主要以糖蛋白、糖脂和糖肽等糖化合物的形式
6、参与生命活动； 发挥生物学功能的多为寡糖残基。,高级生物化学,功能性低聚糖,低聚果糖、低聚水苏糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖等。 功能性低聚糖的吸收： 人体肠胃道不含水解某些低聚糖的酶系统，故不能被消化吸收； 直接进入大肠被双歧杆菌利用，是肠道有益菌的增殖因子，因此这些功能性低聚糖又被称为益生元。,现已发现在激素、抗体、维生素、生长素和其他各种生物大分子中都有寡糖的存在。 寡糖也存在于细胞膜表面，整个细胞膜表面都覆盖有寡糖。 寡糖在生物大分子及细胞间的相互作用中发挥着信号功能，桥梁作用。,高级生物化学, 寡糖的分类和结构类型,寡糖种类繁多，构成寡糖的单糖在自然界分布广； 意义较大的是五
7、碳糖和六碳糖，尤其以六种单糖组成为多： 葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、半乳糖(galactose)、木糖(xylose)、阿拉伯糖(arabinose)和甘露糖(mannose)。,高级生物化学,根据构成寡糖的单糖种类可将寡糖分为同源寡糖(均一)，即由同一种单糖反复成苷结合而成的寡糖； 异源寡糖(不均一)，即由两种或两种以上单糖构成的寡糖及其衍生物； 寡糖侧链化学修饰包括：胺基化、羧基化、磺酸化、磷酸化等。,高级生物化学, 寡糖的生物学活性,与多糖相比，由于寡糖分子量较小，结构简单，溶解性较强，稳定性和安全性都远高于多糖； 同时许多多糖链在经过不同形式的断裂后，使原有生物
8、活性大大提高，有些甚至产生了特殊活性，同时寡糖还具有低毒特征，因此目前对寡糖活性的研究极为重视。,高级生物化学,寡糖是生物体内重要的信息物质，参与细胞接触与识别。如： 在细胞表面、细胞之间通讯，识别和相互作用； 在胚胎发育，细胞代谢，信号传递，细胞运动与黏附，以及病原与宿主细胞的相互作用等方面起着重要作用。,高级生物化学,有些寡糖能激活植物的自我防卫系统。 有些寡糖能诱导根瘤菌的固氮作用。 有些寡糖可与入侵微生物上的糖蛋白相结合，从而阻止这些微生物对人体正常细胞的侵袭。 有些寡糖具有抗菌、抗病毒及提高免疫活性的功能。 一些寡糖具有肝素的凝血功能。 研究表明：血型决定族寡糖很有希望成为防治癌症的
9、药物。,高级生物化学,寡糖具有营养保健功能 由于人体不具备分解、消化寡糖的酶系统，在摄入之后，它很少或根本不产生热量，可有效地防治肥胖病、高血压、糖尿病等。 纯寡糖如：乳果糖、果聚糖、大豆低聚糖、异麦芽糖等可导致双歧杆菌生长因子； 寡糖被双歧杆菌发酵脂肪酸肠道内pH值下降有害菌群调整微生物群落的合理分布B族维生素、促进肠蠕动、蛋白质吸收加快提高免疫力。,高级生物化学,寡糖研究现状,寡糖原料难得、制取困难，例如：某些糖蛋白、糖脂上寡糖链 许多高活性寡糖还处于试验阶段，制备方法：合成或降解为主 分离检测技术尚不完善 因此，寡糖研究缓慢, 海洋寡糖的生物活性,海洋寡糖来源于海洋生物的寡糖类 代表物质
10、：几丁寡糖、褐藻寡糖、卡拉胶和琼胶寡糖等。 来源丰富，结构独特， 结构与内源性寡糖有很多相似点，因此具有巨大的实用性和开发潜力。,高级生物化学,卡拉胶寡糖的抗肿瘤活性： 对小鼠S180肉瘤具有抑制作用； 促进超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性，具有抗氧化功能。 促进效果硫酸取代低硫酸取代高推测抗肿瘤活性主要来源于抗氧化活性、免疫调节功能。,高级生物化学, 寡糖生物活性的作用机理,寡糖类的生物活性通常是建立在细胞水平，主要作为调控因子或信号传导因子。 目前对寡糖在细胞表面受体功能区域及精确定位功能有了较深入的了解，这为发展新一代寡糖药物奠定了理论基础。 寡糖类药物主要涉及：分子间
11、的相互作用与契合，所以对其结构要求非常严格。 特点：专一性高、效力高、副作用低和抗药性低等优点。,高级生物化学,糖类化合物的化学修饰及其 对生物活性的影响,许多糖类化合物本身具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤活性，但由于毒副作用较大，限制了其作为药物应用。 进行化学修饰可起到下列作用： 提高生物活性，降低毒副作用，通过抗病毒、参与细胞间信号传导、抑制干扰或阻断病毒复制、抑制酶的活性等途径发挥药效。因此化学修饰被高度重视。,高级生物化学,卡拉胶及其分解的寡糖,卡拉胶是由某些红藻的细胞壁中提取的一种多糖(属于细胞壁多糖)； 我国早期称其为咖啦胶、角叉莱胶、麝角菜胶等，后统称为卡拉胶。,卡拉胶：一种硫酸半乳聚
12、糖 卡拉胶结构特点： 1,3-D半乳糖和1,4-D半乳糖交替连接形成骨架结构。 根据半乳糖中是否含有内醚以及半乳糖上硫酸基的数量和连接位置不同区分为-、-、-、-、-、-、-七种类型。 常见的卡拉胶多为-、-、-型,高级生物化学,高级生物化学,高级生物化学,卡拉胶的基本性质,理化性质、组成与结构： 溶于热水，不溶于有机溶剂； 凝胶强度和粘度：受分子量、离子强度、盐、氧化剂及其他化学物质的影响。 卡拉胶(凝胶和非凝胶)与蛋白质反应： 通过硫酸基与离子型蛋白质分子发生离子反应。 反应依赖于蛋白质等电点、环境pH值、卡拉胶与蛋白质比率等。,高级生物化学,卡拉胶的应用,卡拉胶性能优良，具有极好的凝胶特
13、性和流变特性，能与其它食品胶共溶并有协同增效作用，因此，在食品、医药、日化及其它科研领域有着极为重要的应用。 最主要的是食品添加剂(如凝固剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、增稠剂等)，广泛应用于果冻、饮料、乳制品、肉制品等食品工业。,高级生物化学,卡拉胶的生物学活性,卡拉胶是一种有效的体内致炎剂，广泛用于各种抗炎剂的检验。 卡拉胶有较强的抗病毒活性。 是有效的抗胃蛋白酶、抗溃疡、抗凝、抗栓物质； 具有：抑制胃蛋白酶活性、保护组织、抑制溃疡、抗凝血、清除血脂等功能。,高级生物化学,硒化卡拉胶的生物活性,保护心脏； 抗氧化； 免疫调节； 降血糖； 抗肿瘤； 安全性好,高级生物化学,海藻多糖的研究与进展,
14、五年前，海藻产业经济低下，出现了自二十世纪六十年代以来的最低潮，但近几年来又有了大幅度的提升。,2005年前后，支撑海藻产业的褐藻胶、琼胶、卡拉胶及甘露醇的价格持续下跌。 例如：卡拉胶，从上个世纪八十年代中期的23万元吨下降到当时的34千元吨。 原因：海藻产品应用面窄，是限制我国海藻工业迅速发展的直接因素。 所以，拓宽海藻产品用途，用高新技术改造传统海藻化工产业，已成为我国当时必须面对的问题，卡拉胶的高附加值化就是其重要的研究议题之一。,高级生物化学,未降解卡拉胶的局限性,分子大，粘度大，扩散困难，吸收困难； 毒性大，未等达到有效剂量就将试验动物致死。 因此，大大地限制了其应用。 所以，对海藻
15、多糖的设计改性，降解、修饰和结构衍变等研究，是获得有重要开发价值的海洋功能食品、保健品和海洋新药、增加产品的技术含量，促进海藻化学工业蓬勃发展的必由之路。 近几年来在此思想的指导下使卡拉胶改造研究取得了极大的进展。使得今天的卡拉胶功能和活性、利用价值有了大大提高，其价格也已达到了19.5万/吨。,高级生物化学, 大豆低聚糖,大豆低聚糖主要分布于大豆胚轴中, 主要成分：水苏糖、棉子糖。 大豆水苏糖和棉子糖属于贮藏性糖类,在未成熟豆中几乎没有,随种子成熟含量递增。 但当大豆发芽、发酵或者大豆贮藏温度低于15、60%相对湿度条件下,水苏糖、棉子糖含量也会减少。,高级生物化学,棉子糖分子式,-D-呋喃
16、(型)果糖基-O-D-吡喃半乳糖基-(16)-D-吡喃葡糖苷,高级生物化学,水苏糖分子式,高级生物化学,1,6,6,1,1,2,大豆及大豆制品中水苏糖、棉子糖含量(%),高级生物化学,大豆低聚糖理化特点, 有甜味：甜度=70%蔗糖；产热低：2千卡/克, 热值=50%蔗糖 可以替代蔗糖作为低热能甜味剂 无色透明液体，粘度：麦芽糖大豆低聚糖异构化糖 保温、吸湿性：小于蔗糖，优于果糖和葡萄糖 水分活性：接近蔗糖 可用于清凉饮料和焙烤食品； 可降低水分活性，抑制微生物繁殖； 可起到保鲜、保湿效果,高级生物化学, 酸性热稳定性强，大于果糖低聚糖和蔗糖 140时开始热分解 适用于需要加热杀菌的酸性食品。
17、90，pH3.5,30min低聚糖受热后残存率： 大豆低聚糖：90% 蔗糖：70%80%; 果糖低聚糖：40%45%。 大豆低聚糖属非还原糖，在食品加工中添加,可减少美拉反应，降低营养素的损失，并且使用方便。,高级生物化学, 具有明显抑制淀粉老化作用 如在面包等面类食品中添加大豆低聚糖,能延缓淀粉的老化，防止产品变硬，延长货架期,大豆低聚糖的生理功能, 难消化 水苏糖、棉子糖不会被人体消化酶分解，也不会被小肠消化吸收 当到达消化道下部时，可被肠内双歧杆菌利用。, 双歧杆菌对大豆低聚糖的选择利用率,精制大豆低聚糖：水苏糖71%、棉子糖20%、其他成份2%。 因此，大豆低聚糖的主要成分水苏糖、棉子
18、糖，二者特别容易被双歧杆菌利用，难被肠内有害菌利用（肠内有害菌荚膜梭菌，大肠杆菌几乎不利用）。, 增殖双歧杆菌、改善肠内菌丝,人们食用大豆低聚糖及加入双歧杆菌的食品时，会对肠内菌丝产生良好影响。 抑制肠内腐败物的生成 抑制肠道氨的生成 抑制有害物质，促进某些酶活性 如：可使-葡萄糖醛酸苷酶、偶氮还原酶、致癌物质生成酶活性下降。, 改善排泄功能,大豆低聚糖不能被人体直接消化、吸收。 到达回肠时，就成为双歧杆菌的“食饵”。 促进肠道内有益细菌活化、增殖，可增进肠道健康，产生“整肠功能”。低聚糖肠内有益细菌(双岐杆菌)增殖整肠作用改善便秘净化肠道, 安全性和保健性,急性、亚急性毒性试验、诱变性试验证
19、实： 大豆低聚糖不存在安全问题 以腹泻为指标，大豆低聚糖的最大作用量 0.64克/kg体重（32g/50kg）具有降低血液胆固醇、降血压、增强免疫功能，具有防癌、抗衰老作用，不引起龋齿等保健功能。,大豆及大豆制品中水苏糖、棉子糖含量(%),高级生物化学,1.3 多糖的研究,多糖又称多聚糖(polysaccharide)单糖聚合而成，聚合度大于20的极性复杂大分子，分子量为数万数百万。 高等动植物细胞膜和微生物细胞壁的天然高分子含碳化合物，它是生命活动4大基本物质之一。 按其来源不同，可分为5大类： 真菌多糖、高等植物多糖、藻类地衣多糖、动物多糖、细菌多糖。 目前已发现的活性多糖有几百种。,高级
20、生物化学,研究表明：多糖具有多种生物活性，这对维持生物机能密切相关。 多糖可与蛋白质、脂类形成糖蛋白和脂多糖。在细胞的识别、分泌以及在蛋白质的加工和转移方面起着不容忽视的作用。 自20世纪50年代末人们发现真菌多糖具有抗肿瘤活性，此后，多糖的研究越来越受到重视。,高级生物化学,1.3.1 均一多糖,由一种单糖缩合而成的多糖均一多糖，如：戊糖胶，木糖胶, 阿拉伯糖胶、己糖胶(淀粉、糖原、纤维素等)。多糖在水溶液中不形成真溶液，只能形成胶体溶液，甜味很淡，无还原性，有旋光性，但无变旋现象。,高级生物化学,几种常见的均一多糖, 淀粉（直链淀粉、支链淀粉） 糖原 纤维素上列都是由葡萄糖通过不同的糖苷键
21、连接而成的多糖。,高级生物化学,几丁质(chitin),几丁质也称壳聚糖，大量存在于昆虫和甲壳类动物的甲壳之中。因此，几丁质又被称为甲壳素。 虾、蟹壳中富含的甲壳素为白色、无定形半透明物质。 据报道，自然界中每年生成的几丁质约有一百亿吨。在天然多糖中几丁质的贮存量占第二位，仅次于纤维素。,高级生物化学,几丁质结构,几丁质是由乙酰氨基葡萄糖聚合而成的均一多糖。也称聚乙酰氨基葡糖(或壳多糖)。 在提纯和水解几丁质时可得到寡糖成分，如：2-乙酰氨基-2-脱氧基-D-吡喃葡糖的同聚物；是-l,4-糖苷键连接成的无分支长链结构。 几丁质也可视为纤维素的类似物。相当于葡糖的C-2位上-OH由CH3-CO-
22、NH-取代。 几丁质难以单独存在于自然界，一般以与蛋白质络合或共价结合形式存在。,高级生物化学,几丁质的结构 和构象,高级生物化学,-1,4,几丁寡糖生理功能,a. 植物调节功能 几丁质酶诱导产生的自我防御激活剂： 在几丁质酶作用下，几丁质降解寡聚糖片段诱导植物防御素分泌自我防御功能； 高几丁寡糖功能： 阻碍病原菌生长繁殖 几丁寡糖功能： 调节植物基因关闭与开放， 促进植物细胞活化，提高防御功能,刺激植物生长。,高级生物化学,b. 几丁寡糖有促进双歧杆菌生长功能,双歧杆菌促生长因子之一； 调节动物肠道微生物代谢活动，改善微生物的分布； 促进双歧杆菌生长繁殖，提高机体免疫力，使肠道内pH下降；
23、抑制肠道有害菌生长，产生B族维生素； 分解致癌物，促进肠蠕动，增进蛋白质吸收。,高级生物化学,c. 提高机体免疫力,几丁寡糖抗感染作用机理： 某刺激机体腹膜渗出液细胞增加激活巨噬细胞增加活性氧的生成氧化性杀菌机制增强抗感染作用增加； 对巨噬细胞的激活可产生下列作用: 激活T淋巴细胞杀伤活性增强；原因:释放巨噬细胞激活因子（MAF）激活巨噬细胞 因此认为：几丁寡糖杀伤活性的产生主要是激活T淋巴细胞与巨噬细胞，且使其相互加强所至。,高级生物化学,d.应用进展与市场前景,几丁寡糖在精细化工领域应用广泛： 有良好的保湿增湿作用，抑制皮肤表面细菌活化，可应用于美容、化妆、抗衰老等精细化工研究领域。 是一
24、种性能优异的日化原料，市场前景广阔。,高级生物化学,几丁寡糖在生物医药领域应用,制备抗癌药物 特别是68糖的低聚体，可通过活化人体淋巴细胞达到抑制癌细胞的繁殖和扩散达到抗癌作用。 癌细胞的形成伴随大量癌毒素的释放人体中的铁质贫血、食欲减退， 几丁寡糖：在人肠内可形成小分子基团易被吸收，抑制癌毒素在体内的释放。 几丁寡糖：一种良好的聚电解质可吸附在血管内皮细胞表面抑制癌细胞转移。,高级生物化学,甲壳质和壳聚糖在调血脂、降胆固醇方面有功效； 这些多糖无毒、不产生变态反应，对机体具有温和的免疫刺激作用，使其在调血脂、降胆固醇药物方面具有优势。 浙江省温岭市已用壳聚糖的系列产品开发了康达舒降血脂片。,
25、高级生物化学,据报道：,保健食品领域,几丁寡糖作为自然界中一种碱性多糖，生物活性高，无毒、无副作用，可被机体快速吸收。 以几丁寡糖为主要原料生产的保健食品能够提高机体免疫力，活化细胞，促进肠道双歧杆菌等有益菌的增生，并抑制有毒菌的生成。 目前几丁寡糖的主要消费地在日、韩、美、法、俄等国家。,高级生物化学,我国科技部在“十五”攻关计划中将“壳寡糖新产品的开发应用” 列为重要项目。 要求建立数条年产500吨以上的壳寡糖生产线，以满足国内市场的需求。 壳寡糖作为一个具有一定前瞻性的医药新产品，国内外市场前景广阔。,高级生物化学,农林畜牧领域,壳寡糖具有良好的抗病虫害功能，而且具有安全、微量、高效、成
26、本低等优点。 壳寡糖是生物杀虫剂的良好原料。,高级生物化学,展望,开发应用壳寡糖是甲壳质行业的必然方向，也是当今生物制药技术的一个亮点。 目前壳寡糖产品的年需求量在6000吨以上，其科研开发主要集中在日本、韩国等国家。20世纪90年代末，酶法生产壳寡糖在日本、韩国实现了产业化。 我国对该产品的研究起步较晚，近年来趋于活跃，作了大量的工作。 2002年8月，山东济南海得贝公司利用复合酶法制备壳寡糖的生产线正式投产，预示着在我国也第一次实现了壳寡糖的产业化生产。,高级生物化学, 真菌多糖,是由真菌实体和菌丝体所产生的一类代谢产物。 目前，在全球范围内约有数千种真菌。其中不仅有许多有实用价值的美味真
27、菌，也有许多具有保健功能的真菌。当然也有一些有毒性真菌。 活性真菌多糖：分为纯多糖和杂多糖两类 纯多糖：20个以上的单糖通过糖苷键连接而成，可分为直链和支链结构。 杂多糖（复合多糖)：由糖链和肽链或脂类组成。 目前己开发的活性多糖：灵芝多糖，香菇多糖，猴头菇多糖，茯苓多糖，银耳多糖等。,高级生物化学,活性真菌多糖的主要功能： 刺激免疫活性，增强网状内皮系统吞噬肿瘤细胞作用，促进淋巴细胞转化，激活T细胞和B细胞，促进抗体的形成。具有抗肿瘤的活性。但对于肿瘤细胞并无直接的杀伤作用。 能降低甲基胆蒽诱发肿瘤的发生率，对一些易发生转移，不易采取手术治疗的肿瘤，如：白血病，淋巴瘤等，有特殊功效。,高级生
28、物化学,1.3.2 不均一多糖,糖胺聚糖，又称为糖胺多糖、粘多糖、氨基多糖、酸性糖胺聚糖等。 糖胺聚糖可通过共价键与蛋白质相连接构成蛋白聚糖。 存在于软骨、管腔等结缔组织中，构成组织间质。如：各种腺体分泌的润滑粘液等。,高级生物化学,糖胺聚糖在组织生长、再生、受精过程中、在机体与各种传染病原体(细菌、病毒)的相互作用过程中都起着重要作用。代表物质如：透明质酸、软骨素4-或6-硫酸、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素等。,高级生物化学,细菌细胞壁多糖,高级生物化学,细菌细胞壁多糖,（脂多糖）,（细胞周质间隙）,高级生物化学,高级生物化学,粘多糖结构,GalNAc-6s：N-乙酰半乳糖-
29、6磺酸,高级生物化学,GlcUA：葡糖酸,Gal：半乳糖,GLcNAc：N-乙酰葡糖胺,细胞壁多糖与蛋白连接,高级生物化学,高级生物化学,透明质酸(hyaluronic acid),透明质酸是糖胺聚糖中结构最简单的一种，它的结构中含有重复的二糖结构单位：,高级生物化学,透明质酸的功能,同时存在于高等动物组织中和某些细菌中，如A型链球菌等。 功能：在组织中吸附水分，起润滑剂作用。广泛分布于哺乳动物体内，特别是润滑液、玻璃样体液中，此外关节液、疏松结缔组织、脐带、皮肤、动脉管壁、心脏瓣膜、角膜以及雄鸡冠中也较多。,高级生物化学,硫酸软骨素4（或6）,分为： 软骨素-4-磺酸 软骨素-6-磺酸 两者
30、间除黄酸基位置不同，红外光谱差别较明显外，其余理、化性质均较接近。 磺酸软骨素含有重复的二糖单位，其结构如右图：,高级生物化学,最初从猪皮中分离，后发现存在于许多动物组织，如猪胃粘膜、脐带、肌腱、脾、脑、心瓣膜、巩膜、肠粘膜、关节囊、纤维性软骨等组织中。 结构与性质都与硫酸软骨素相似，其二糖结构如图：,高级生物化学,硫酸皮肤素,硫酸角质素,首先从角膜蛋白水解液中分离得到，后证明在人主动脉和人、牛的髓核中也存在。 婴儿几乎不含硫酸角质素，随着年龄的增大产生并逐渐增加，直到20-30岁时，它的含量约占肋软骨中粘多糖总量的50%。,高级生物化学,重复二糖单位,肝 素,肝中肝素含量最丰富。但也广泛分布
31、于哺乳动物组织和体液中。猪胃粘膜中含量十分丰富，肺、脾、肌肉和动脉壁肥大细胞中含量也很高。生物学意义：抗血液凝固 目前输血时，多以肝素为抗凝剂，临床上用于防止血栓形成。,高级生物化学,重复二糖单位,1.4 复合糖,多糖与非糖物质如脂或蛋白质共价结合，分别形成脂多糖、糖脂、糖蛋白和蛋白聚糖，统称为复合糖。 复合糖普遍存在生物界，在体内具有多种生物活性功能。,高级生物化学,1.4.1 脂多糖,脂多糖种类繁多，革兰氏阴性细胞壁含有非常复杂的脂多糖。分子结构多由三部分组成，即：,高级生物化学,中心多糖链,高级生物化学,脂多糖中脂质结构,高级生物化学,脂多糖结构和功能的关系,细菌脂多糖外层寡糖链是细菌致
32、病关键 磷酸基可与其它离子结合，对维持菌体细胞壁的离子环境起重要作用； 外层寡糖链和中心多聚糖中的某些单糖对细菌生长并不是必需的。,高级生物化学,1.4.2 糖蛋白及蛋白聚糖,多糖以共价键形式与蛋白质连接形成的生物大分子。,高级生物化学, 糖蛋白（glycoprotein）,分布于动物、植物、真菌、细菌及病毒体内的复合糖。几乎所有细胞均可合成。 糖蛋白短链寡糖与蛋白质共价结合，以蛋白质为主，是含糖量变化较大的一类复合糖。如： 胶原蛋白含糖量：1%可溶性血型物含糖量： 85%多数含糖量较低 糖蛋白中的糖多为半乳糖或甘露糖的衍生物，如：N-乙酰氨基多糖等；,高级生物化学,连接方式糖肽键,寡糖与多肽
33、(蛋白质)中氨基酸以共价连接，构成糖肽连接键，简称糖肽键，其类型可概括如下：1以ser、Thr、Hyp、Hyl的-OH为连接点，形成-0-型糖肽键；2以Asn的-CO-NH2、N-末端氨基酸的-HN2以及Lys或Arg的R-NH2为连接点，形成-N-型糖肽键；3以Asp或Glu的游离-COOH为连接点，形成-CO-O-型糖肽键型；4以Cy-SH为连接点， 形成-S-型糖肽键。,高级生物化学,糖蛋白的功能,糖蛋白可被分泌进入体液或作为膜蛋白。 许多酶类、蛋白质类激素、血浆蛋白、所有的抗体、补体因子、血型物质和粘液组分以及许多膜蛋白均属糖蛋白。,高级生物化学,蛋白聚糖(proteoglycan),
34、由蛋白质与糖胺聚糖共价连接而成。 其中糖胺聚糖含量高，链长并且无分支，并具有二糖重复单位，含较多的酸性基团（羧基、磺酸基等），是负性较强的大分子，如：透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素等均属此类。 蛋白聚糖的功能与糖胺聚糖酸性基团密切相关。,高级生物化学,糖胺聚糖与蛋白质连接的三种方式：,D-木糖与Ser-OH之间-O-糖苷键 N-乙酰半乳糖与Thr、Ser间形成的-O-糖苷键 N-乙酰葡糖胺与Asn形成-N-糖苷键蛋白质居中间，构成核心蛋白。 糖胺聚糖分子排列在蛋白质两侧，称为蛋白聚糖“单体”,高级生物化学,高级生物化学,连接方式和多样性,高级生物化学,(Asn),(Thr),膜蛋白中的
35、糖,高级生物化学,膜蛋白分子中的糖,高级生物化学,糖蛋白分子中的多糖,高级生物化学,糖蛋白分子中的多糖,高级生物化学,1.5 多糖的分离纯化,多糖是极性大分子化合物，多易溶于水，不溶于乙醇。 常用水、稀碱溶液抽提，氯化钠梯度洗脱。 超声处理可加速多糖释放注意：在较强的碱性溶液中多糖可被水解,高级生物化学, 动物多糖的提取,动物多糖特点：显酸性，存在结缔组织中，多与蛋白质结合 常用三种分离方法： 碱溶液提取法； 中性盐溶液提取法； 蛋白酶消化法。 蛋白酶消化法为最佳，降解少，产量高。 例如：鹿茸中酸性多糖的提取木瓜酶消化鹿茸渣+木瓜酶+酶活化剂60水浴消化24h 上清液(沉淀可反复处理)加醇将多
36、糖沉淀析出,高级生物化学,植物多糖的提取,植物根、茎、叶、花、果、种子中存在大量多糖。 植物多糖多不溶于冷水，在热水中呈粘液状，遇乙醇沉淀被分离。 单一植物多糖的分离提取极为困难。 对含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子等，应先脱脂，再水提。 对含色素较高的样品，需先脱色处理。,高级生物化学,分离植物单一多糖的一般流程,用水或甲醇等有机溶剂浸泡（浸提）； 低温减压（浓缩）； 流水透析（除小分子）； 凝胶柱层析（分离纯化）； 冷冻干燥(得较单一多糖)； 高效液相色谱或凝胶层析（测定其纯度、分子量）； 酸解气-液相层析或纸层析（测定其单糖组成）如人参多糖(panaxans)，苍术多糖(atracta
37、ns)，乌头多糖(aconitans)，栝萎根多糖(trichosans)，紫草多糖(lithospermans)等提取均可用上列方法。,高级生物化学, 菌类多糖的提取,除去小分子杂质透析法(用不同型号透析膜)。 除去游离蛋白质由Sevag法，三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法。三者均为沉出法。注：前两种方法常用于微生物，后者多用于植物。它们均不适于糖蛋白，因为，可将糖同时沉除。 糖蛋白质中蛋白质的去除：蛋白酶破坏蛋白质与糖的结合，再除蛋白质。,高级生物化学,a. Sevage 法：,依据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点： 样品中加入：氯仿:戊醇(或正丁醇)5:1 (或4:1)混合物剧烈振摇2030
38、min（蛋白质与混合物生成变性凝胶状而被分离）离心 除去变性蛋白质（水层和溶剂层分界处） 优点： 抑制降解，如配合蛋白质水解酶效果更佳。,高级生物化学,胰蛋白酶-Sevage法联用脱除柿多糖蛋白,由正交实验找出酶法脱蛋白的最优条件，比较酶法、Sevage法、酶-Sevage联用法的脱蛋白效果和多糖保存率。实验工艺： 胰酶液(1mg/ml)和粗多糖液(50mg/ml) 以0.41，37 5h，加0.2倍体积pH7.0的10%的H2O2，过夜； 再加1/3 体积氯仿-正丁醇(Sevage)，充分混合20min，4000r/min 离心5min，重复3次,至两相界面无蛋白沉淀，透析24h，得水提多糖
39、精品，4保存。 此时，蛋白质含量为0.368mg/ml，多糖含量为86.9%，蛋白的脱除率为83.8%。 结论：酶-Sevage联用法对蛋白脱除率和多糖保存率均较高，工艺简单，适宜于脱除柿多糖蛋白。,高级生物化学,案 例,猴头多糖脱蛋白方法的研究,Sevage法脱蛋白 配制1%的猴头粗多糖溶液, 加入1/ 4 体积的Sevage试剂(V氯仿V正丁醇= 41)振摇20min 静置30min 离心除去沉淀。 测定上清液中多糖和蛋白质的含量。 上清液重复以上脱蛋白步骤，直至离心无沉淀产生.,高级生物化学, 三氯醋酸法脱蛋白(TCA),配制1%的猴头粗多糖溶液加入TCA 振摇20 min 静置30 m
40、in 离心除去沉淀，测定上清液中多糖和蛋白质的含量。最佳TCA 用量选择： 试验中摸索TCA 用量(对糖液质量比) 分别为0. 1%、0. 5%、1%、2. 5%、5% ,做单因子实验，找到除蛋白后含糖量最高、含蛋白量最低的配比。,高级生物化学,b. 三氟三氯乙烷法：,多糖溶液:F3C-CCl3=1:1混合低温搅拌10min离心取上层水层（多糖层），弃沉淀。 水层继续用上述方法处理几次，即得无蛋白多糖溶液。 特点：效率高，但溶剂沸点较低，易挥发，不宜大量使用。以上方法均不适合糖蛋白。,高级生物化学,c. 三氯醋酸法（TCA）：,多糖水溶液滴加5-30%三氯醋酸直至不再继续混浊在510放置过夜离
41、心弃沉淀无蛋白质多糖溶液。 缺点：引起某些多糖降解不适合糖蛋白。,高级生物化学,d.糖蛋白的蛋白分离,对碱稳定的糖蛋白在硼氢化钾（KHB3）存在下用稀碱温和处理糖与蛋白质结合点打开将蛋白质沉淀离心弃去得到多糖溶液。,高级生物化学,多糖的纯化, 沉淀法 分部沉淀法、盐析沉淀法、金属络合物沉淀法和季铵盐沉淀法等。安络小皮伞粗多糖的纯化：小皮伞粗多糖水溶液 + 斐林试剂 调溶液达到不同乙醇浓度得多种多糖（乙醇分级分离）,高级生物化学,斐林试剂：碱性硫酸铜（配置成甲、乙液。用时按要求混合。,醇沉流程：,多糖水溶液浓缩加入95%乙醇醇沉（醇的终浓度依多糖的结构和性质，在70%-85%范围内）静置24h分
42、离沉淀弃小分子杂质弃蛋白质脱色再醇沉沉淀分别用95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤60减压干燥。,高级生物化学,凝胶柱色谱法,选琼脂糖凝胶(Sepharose)作吸附剂，以不同浓度的盐溶液和缓冲液作洗脱剂，使各种多糖得以分离纯化。 日本学者用Sepharose-6B、Sephacryl S-200和S-500等色谱柱对人参粗多糖进行反复分离纯化，并经透析和Sephadex-G10 处理，最后分出21种均一性多糖。但此方法不适宜粘多糖的分离。,高级生物化学,阴离子交换树脂层析法,最常见的： 交换剂DEAE-纤维素(阴离子交换树脂，硼酸型或碱型)； 洗脱剂：可用不同浓度的碱溶液、硼砂溶液、盐溶液等。目前
43、此法常用于纯化多糖。 还适于分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。,高级生物化学,太子参多糖分离：粗多糖加水溶解透析DEAE-纤维素柱层析，以02mol/L NaCl 水溶液梯度洗脱SephadexG-100柱层析精制得两种均一多糖。另外：超滤法、制备性区域电泳法、活性碳柱层析等也可起到一定的分离作用。,高级生物化学,1.6 多糖的纯度分析,纯度判断基本原则：糖基摩尔比恒定；电泳呈一条带；柱层析呈一个峰。,高级生物化学,电泳法：,醋纤膜电泳；玻璃纤维纸电泳；PAG电泳；琼脂糖凝胶电泳等。中性糖导电弱、分子量大、在电场中移动慢，故常需加高电压、pH9-12硼酸缓冲液，(糖类易与硼酸离子结合形成配合
44、物，从而增加导电性) 可用阿利新蓝、甲苯胺蓝、P-茴香胺硫酸试剂、高碘酸希费试剂等显色。,高级生物化学,凝胶柱层析法： 常用sephadexG-150、G-200或DEAE-纤维素，若呈一个峰则证明纯度较高； 紫外扫描法： 可测出多糖中是否混有核酸或蛋白质，多糖的紫外特征吸收峰应为200nm； 其他方法： 官能团分析、纸层析、水解糖组分分析。,高级生物化学,1.7 多糖的含量测定,总糖测定 硫酸-蒽酮法：蒽酮可与多糖中的己糖基、戊醛糖和己糖醛酸反应 蒽酮试剂：2g蒽酮溶于1000mL80%(V/V)硫酸制得； 操作：样液1mL + 蒽酮试剂4mL沸水浴10min 反应液呈绿色(620nm有最大
45、吸收峰)测A620nm 可通过标准曲线查出溶液中多糖含量。 糖醛酸含量：用硫酸-咔唑法； 氨基葡萄糖含量：用乙酰丙酮显色法。,高级生物化学,1.8 多糖分子量测定,化学法：多糖因其分子不均一性而使分子量测定较难，常只测其统计均值。 凝胶柱层析：首先用一系列结构相似、已知分子量的多糖作标准曲线；再将分离样品液上样。观察洗脱时间、体积等确认其分子量。洗脱液显色：用硫酸-蒽酮法或硫酸-苯酚法显色 特性粘度法：常用结构相似已知多糖决定K值(= K M 2 )，然后测出待测多糖的粘度，最后，计算其分子量M。,高级生物化学,1.9 多糖结构分析的基本方法,多糖的组成成分测定酸水解乙酰解甲醇解 过碘酸氧化及
46、Smith降解 酶降解测定法详见糖化学分析论著,高级生物化学,1.10 应用举例1,不同溶剂分级提取茶多糖的组成及降血糖活性 分离简介：从茶叶中分离出高活性的茶多糖，比较其不同溶剂分级分离茶多糖的得率、含量、单糖组成及降血糖活性差异。具体流程如下： 粗老绿茶去离子水低温提取水溶性多糖TPS草酸铵提取果胶类多糖TPS （水不溶性多糖）碱提取碱溶性多糖TPS （所得到碱提取液回调至pH中性） 分析TPS、 得率、含量，采用气相色谱和离子色谱分析单糖组成。,高级生物化学,组成分析：,复合纤维素酶提取与去离子水提取在得率、含量、单糖组成上进行比较： 单糖组成特点： TPS：以鼠李糖、半乳糖和半乳糖醛酸
47、为主； TPS：以半乳糖和半乳糖醛酸为主； TPS：以阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖为主。,高级生物化学,降血糖活性分析：,四氧嘧啶腹腔注射高血糖模型，连续灌胃茶多糖12d，对比茶多糖的降血糖活性。 降血糖活性顺序为： TPS TPS TPS 酶提茶多糖较水提茶多糖降血糖效果明显; 水溶性多糖(TPS)降血糖活性最好； 复合纤维素酶提取可提高其得率,增强其活性。,高级生物化学,得率分析：,TPS得率最低； 复合纤维素酶提取多糖得率、糖醛酸得率比热水提取得率高1.53倍和1.42倍。,高级生物化学,1.11 举例2：,不同酶法提取工艺对茶多糖组成的影响 简介： 采用果胶酶、胰蛋白酶及复合酶等3 种酶法
48、提取和不加酶水浸提法为对照，提取崂山粗老绿茶中的茶多糖（TPS）。 结果表明，复合酶提取法的提取率最高，达到5.170.17%。,高级生物化学,结果表明：,4 种工艺对提取的TPS 的单糖组成种类影响不大，但对各单糖组分之间的比例稍有影响。 4 种工艺获得的TPS 的总糖含量由高到低依次为果胶酶法、复合酶法、胰蛋白酶法以及不加酶水浸提法，其中果胶酶法获得的TPS 总糖含量高达95.264.09%， 但其糖醛酸含量比其他3 种工艺显著降低。 4 种工艺对提取的TPS 的氨基酸组成种类影响亦不大，但对各氨基酸的含量有较大的影响。 果胶酶法、胰蛋白酶法提取的TPS 各氨基酸含量与不加酶水浸提法的相比减少很多。,高级生物化学,End,
