1、钙通道抑制剂对川百合花粉萌发的影响第 28 卷第 5 期2004 年 9 月河北师范大学(自然科学版)JournalofHebeiNormalUniversity(NaturalScienceEdition)V01.28NO.5钙通道抑制剂对川百合花粉萌发的影响尚忠林,李建华,李冰(河北师范大学生命科学学院,河北石家庄 050016)摘要:细胞内钙离子在花粉萌发过程中发挥重要作用 ,钙离子如何被植物花粉细胞所吸收是植物生殖生理研究的热点问题.对一些常用的钙通道抑制剂对川百合花粉萌发和花粉管伸长生长的影响进行了研究.结果表明,萌发中的花粉需要从外界吸收大量钙离子,电压依赖型钙通道的有机抑制剂(异
2、搏定 ,尼群地平,地而流卓)和 3 价无机离子( 镧,铝,钆)可以明显抑制花粉萌发,电压依赖型通道很可能是细胞外钙离子进入萌发花粉的重要途径.关键词:川百合;花粉;钙离子通道;抑制剂中图分类号:Q942.5 文献标识码:A 文章编号:1000 5854(2o04)O5051004花粉萌发和花粉管伸长是植物有性生殖过程中重要的生理反应,作为植物细胞内重要的第 2 信使和营养元素,Ca2 在花粉萌发及花粉管伸长过程中发挥关键作用 .近年来,人们发现体外萌发的花粉从培养基中吸收大量钙离子,降低培养基中的钙离子浓度能够明显抑制花粉萌发,表明细胞外钙离子对于花粉萌发和花粉管伸长生长是必需的.细胞质膜上的
3、 Ca2 通道作为细胞外 Ca2进入细胞质的主要途径,在花粉细胞内钙离子水平调控过程中处于重要位置,到目前为止,Ca2 通过何种通道进入细胞内仍未确定.为探索花粉细胞对 Ca2 吸收的途径,笔者测定了常用的 Ca2 通道抑制剂对川百合(Lili.Ulldaviddi)花粉萌发和花粉管生长的影响,对川百合花粉细胞质膜 Ca 通道的性质进行了探讨.1 材料与方法1.1 材料川百合花粉采白兰州大田,风干后加干燥剂一 70冰箱贮存,使用前 72h 转移到一 20冰箱中干燥保存.1.2 花粉水合取花粉 5mg,加入 BK 溶液 2mL,轻微振荡使花粉散开,浸泡 30min,使花粉粒充分吸水.BK 液含有
4、 1mmol/LCa(NO3)2,1mmol/LKC1,1mmol/LMgSO4,1mmol/LHBO3,0.5mol/L 蔗糖,pH5.8.1.3 萌发率测定取低熔点琼脂糖 1g,加 BK 液 100mL,加热溶解,做成琼脂糖溶胶 .取加热溶解的琼脂糖溶胶 0.5mL,滴加到载玻片上,迅速取 0.5mL 水合后的花粉溶液,滴加到载玻片上,与热琼脂糖混合均匀,并在载玻片上涂成薄层.将载玻片放在保鲜盒中的小支架上,底部加水,保鲜盒加盖后放在培养箱中,25培养以使花粉萌发.每隔 1h 取出部分载玻片,速冻,使花粉萌发和花粉管生长停止.解冻后显微镜下观察,统计花粉萌发率并测量花粉管长度.统计萌发率时
5、一般每次统计 300 粒花粉,测量花粉管长度时统计 3040 根花粉管.重复 3 次求平均值.1.4 药剂处理钙离子螯合剂 EGTA 用 BK 溶液配制;钙通道有机抑制剂异搏定,尼群地平,地而流卓,无机抑制剂氯化镧,氯化铝,氯化钆用 BK 液配制成溶液.在测定萌发率时将上述溶液与水合后的花粉液混合铺片,收稿日期:20040421:修回日期:2004 一 O6 一 O4基金项目:国家自然科学基金资助项1(30370728)作者简介:尚忠林(1970 一),男,河北f头人,河北师范大学副教授,博士后.主要从事植物生理学,细胞生物学研究第 5 期尚忠林等:钙通道抑制 NXCNI 百合花粉萌发的影响
6、511统计萌发率和花粉管长度(方法参照 1.3).2 结果2.1 川百合花粉的体外萌发在 BK 液中,花粉水合后 1h 开始萌发,在 34h 时萌发率最高 ,达到 75%以上;花粉管长度在 45h 时达到最长,平均长度在 3000,am 左右(图 1).在后续的实验中 ,不同实验组比较萌发率时选择第 3个小时的数据,比较花粉管长度时选择第 4 个小时的数据.褂.卜墨暑i拙霎O246时间,h 时间,h圈 1 不同时间川百合花粉萌发率和花粉管长度时间/h量i魁扯O246时间,h圈 2EGTA 对川百合花粉萌发率和花粉管伸长生长的影响2.2EGTA 对川百合花粉萌发率的影响在溶液中含有 5mmol/
7、LEGTA 时,花粉萌发明显受到抑制 .萌发率在 45h 时达到最高,但是萌发率最高只有 12%,只有对照组的 1/8;花粉管伸长生长受到明显抑制,平均为200240ptm,只有对照组的 1/12(图 2).2.3 钙通道有机抑制剂对川百合花粉萌发率的影响在含有钙通道有机抑制剂的培养基中,川百合花粉萌发率和花粉管长度明显低于对照水平(图 3).抑制剂对花粉萌发的抑制效果与其浓度密切相关,分别用 20,50,100,umol/L 钙通道有机抑制剂处理后花粉的萌发率:异搏定为(42.25.9)%,(22.23.3)%,(15.22.1)%;尼群地平为(545.2)%,(36,93.7)%,(28.
8、22.9)%;地而流卓为(384.4)%,(203.1)%,(12.4 1.6)%.花粉管长度:异搏定为(1370267)m,(974l34),am,(449115),am;尼群地平为(2047229)um,(1400512 河北师范大学(自然科学版)第 28 卷164)m,(964145)m;地而流卓为(1423242)m,(1050184)m,(405 ll9),um1008060墨萎 402001o080瓣 6o墨40挂200c(抑制剂)/(p.mol-L-)1oogi越驰弈020501ooc(抑制剂)/(p.mol-L-)图 3 不同浓度有机抑制剂对川百合花粉萌发率和花粉管长度的影响0
9、20501o0c(抑制剂)/(p.mol-.)gi越驰02050100c(印制剂)/(p.mol-L-)图 4 不同浓度无机抑制剂对川百合花粉萌发率和花粉管长度的影响2.4 钙通道无机抑制剂对川百合花粉萌发率的影响在含有钙通道无机抑制剂(3 价阳离子)的培养基中,川百合花粉萌发率和花粉管长度明显低于对照水平(图 4).抑制剂对花粉萌发的抑制效果与其浓度密切相关,分别加入10,20,50,umol/L 的 3 价阳离子处理后,花粉萌发率:氯化镧为(32.85.8)%,(16.43.3)%,(15.22.1)%;氯化铝为(35.75.1)%,(17.23.6)%,(11.22.7)%;氯化钆为(2
10、8,64.4)%,(15.23.1)%,(13.11.65)%.花粉管长度 :氯化镧为 (1370167),um,(76084),um,(44955),um;氯化铝为(1220 127),um,(660104),um,(48075),um;氯化钆为(1142 147),um,(62084),um,(45056),um.3 讨论钙离子是植物细胞中重要的胞内第 2 信使,又是参与细胞壁重建的重要无机营养元素.花粉萌发和花粉管伸长生长的过程中,细胞代谢非常旺盛,花粉管伸长生长过程中细胞壁重建需要大量钙离子,同时,复杂的代谢过程也需要细胞内钙离子发挥调控作用 l3,.细胞内部贮存的钙离子非常有限,从外
11、界吸收的钙离子是满足细胞对钙离子需求的主要途径,因此细胞外钙离子在花粉萌发和花粉管伸长生长过程中发挥的作用一直受到人们的普遍关注,而钙离子通过何种途径进入花粉细胞内成为近年来研究的重点问题.川百合花粉粒个体较大,长期保存后活力也不会丢失,因此成为花粉萌发和花粉管生长研究的模式材料之一.笔者在实验中所用的花粉萌发率较高,达到 80%以上,而且萌发速度比较快,表明花粉的活力比较好,可以用于后续实验.0332211姗姗姗 0332211第 5 期尚忠林等:钙通道抑制剂对川百合花粉萌发的影响 513从实验结果来看,细胞外钙离子与花粉萌发关系密切,在加入钙离子螯合剂 EGTA使细胞外游离钙离子浓度降低后
12、,细胞难以从外界吸收钙离子,花粉萌发受到强烈抑制.在实验初期进行的对照实验中,在无钙的培养基中花粉萌发率只有 4%5%,远远低于在正常 BK 液中萌发的花粉(结果耒给出).上述结果表明持续地从外界环境中吸收钙离子对于花粉的萌发是必需的,很多研究结果都证实了这一点【5,61.植物细胞质膜上存在着张力激活的钙离子通道和电压依赖的钙离子通道,在细胞吸收钙离子方面发挥主导作用,其中电压依赖的钙离子通道受到人们更多关注.笔者采用了一些常用的钙通道抑制剂处理花粉,观察了它们对花粉萌发产生的强烈抑制作用.根据结果推测,在川百合花粉萌发过程中,细胞主要通过对这些抑制剂敏感的钙通道进入细胞内,由于这些抑制剂主要
13、作用于电压依赖的钙通道,所以电压依赖钙通道很可能是萌发花粉从外界环境中吸收钙离子的重要途径.一些研究者对于钙离子吸收途径进行了研究,Feijo 等 J 曾经推测张力激活的钙通道在花粉吸收钙离子方面可能发挥一定作用,但是缺乏进一步的证据支持.Very 等 J 利用膜片钳技术研究了拟南芥根毛伸长生长过程中参与钙离子内流的钙通道的电生理学特征及其对各种抑制剂的反应,指出钙离子是通过超极化激活的电压依赖型钙通道进入根毛细胞内部的.由于根毛的生长与花粉管有相似之处,所以推测在花粉萌发和花粉管伸长过程中,类似的钙通道很可能同样发挥重要作用.他们的实验结果显示,根毛细胞膜上的钙通道对镧离子,铝离子,钆离子和
14、异搏定,尼群地平,地而流卓抑制剂非常敏感.笔者实验结果显示,花粉萌发和花粉管伸长生长对上述试剂同样表现出较高的敏感性,推测在上述生理过程中,参与钙离子吸收的钙通道可能是类似的.在 3 种有机抑制剂中,异搏定和地而流卓的作用效果相似,而尼群地平的作用效果差一些.因为异搏定属于苯氨基醇类化合物,而尼群地平属于二氢吡啶类化合物,在动物体内已经明确 2 类抑制剂分别作用于不同类型的电压依赖性钙通道,川百合花粉对这些抑制剂敏感性的不同对于今后进一步研究细胞质膜钙通道生理学特性有一定的指导意义.参考文献:1BUSHDS.Calciumregulationinplantcellsanditsroleinsi
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20、HebeiShijiazhuang050031,China;2.CollegeofLifeScience,HebeiNormalUniversity,Hebeishijiazhuang050016,China;3.CollegeofResourceandEnvironmentSciences,HebeiNormalUniversity,Hebeishiiiazhuang050016,China)Abstract:TheNandagangwetlandisoneoftheimportantwetlandsinHebeiprovince.Inthearea,thereareplentifulplantresources.Basedontheinvestigation,thestructureandfeatureofplantcommunitywereanalysed,andtheplantresourceswasalsointroduced.Keywords:Nandagangwetland;plantcommunity;plantresources(责任编辑柴键)(上接第 513 页)TheEffectofCalciumChannelBlockersonPollenGerminationofLiliumdaviddiSHANGZhonglin,LIJianhua,LIBing
