1、胶体金免疫层析法检测结核分枝杆菌特 异性IgG/IgM 抗体对结核病诊断的应用 价值 李霜君 张治国 余琴 罗巧 王莉 李晓琴 李马超 刘 海灿 万康林 温州医科大学检验医学院生命科学学院 中国疾病预 防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家 重点实验室 北京市昌平区结核病防治所 北京市朝 阳区疾病预防控制中心 摘 要： 目的 评价胶体金免疫层析法检测血清中结核分枝杆菌特异性 IgG/IgM 抗体在结 核病诊断中的应用价值。方法 收集结核病患者和健康人的血清样本共 332份 (包括260份结核病患者样本和72份健康对照样本) 及其背景资料, 采用胶体金 法检测血清中特异性结核抗体 IgG/
2、IgM, 与临床诊断和细菌学检测结果比较, 使用SPSS 22.0 统计软件对结果进行比较分析, 以P0.05为差异具有统计学意 义。结果 胶体金免疫层析法检测结核病患者中特异性结核抗体 IgG/IgM 的灵敏 度为41.15%、特异性为 91.67%, 检测菌阳和菌阴结核病患者的敏感性分别为 51.38%和 33.77%。在全部结核病患者中, 特异性结核抗体 IgG/IgM 检测检出率 (41.15%) 显著高于痰涂片法 (18.84%) 和痰菌培养法 (36.15%) (P0.05) 。结 核抗体检测、痰涂片法和痰培养法三种方法联合检测阳性率为 61.54%, 高于单 种方法检测或其中两种
3、方法联合检测。结论 胶体金免疫层析法检测血清中结核 分枝杆菌抗体具有灵敏、特异、快速和简便等优点, 可用于结核病的筛查, 同时 该方法也具有一定的局限性, 敏感度和特异度有待进一步的提高, 因此不可单 独用于诊断结核病, 可配合痰细菌学、影像学和临床表现等进行辅助诊断。 关键词： 结核抗体; 结核分枝杆菌; 胶体金免疫层析法; 诊断; 作者简介：万康林, Email: Application value of detecting Mycobacterium tuberculosis specific IgG/IgM antibodies for tuberculosis diagnosis w
4、ith colloidal gold immunochromatography assay LI Shuang-jun ZHANG Zhi-guo YU Qin LUO Qiao WANG Li LI Xiao-qin LI Ma-chao LIU Hai-can WAN Kang-lin School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University; The Institute of Tuberculosis Prevention and Control of District Changping; Be
5、ijing Chaoyang District Center for Disease Control and prevention; State Key Laboratory for Communicable Disease Control and Prevention, Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention; Abstract： In this study, we estimated the application
6、 value of detecting Mycobacterium tuberculosis (MTB) specific IgG/IgM antibodies for tuberculosis diagnosis with colloidal gold immunochromatography assay (GICA) . We collected 332 effective serum samples and their background information, including 260 patients with tuberculosis and 72 healthy indiv
7、iduals. The means of GICA was used to detect MTB specific IgG/IgM antibodies. Results were compared with the clinical diagnosis and the results of bacteriological tests. The SPSS 22.0 software was used to analyze the results, and when P0.05 the difference was statistically significant. The sensitivi
8、ty and specificity of GICA were 41.15% and 91.67%, and the sensitivity of the bacterial positive and negative patients were 51.38% and 33.77%, respectively. The positive rate of IgG/IgM antibodies detection with GICA (41.15%) was much higher than that of bacteria with acid-fast stain of sputum smear
9、 (18.84%) and sputum bacteria cultivation (36.15%) (P0.05) respectively. The Positive rate of the combination of tuberculosis antibody detection, sputum bacterial culture and sputum smear was 61.54%, higher than the result of single method or combination of two methods. The detection of specific ant
10、ibodies against MTB in serum with GICA is sensitive, specific, rapid and convenient, which can be used in clinical screening. Meanwhile, there are still certain limitations of this method, and the sensitivity and specificity need to be improved. Therefore, the GICA can be used as an auxiliary diagno
11、sis combined with sputum bacteriology, imaging test and clinical features rather than diagnose tuberculosis alone. Keyword： tuberculosis; Mycobacterium tuberculosis; colloidal gold immunochromatography assay; diagnosis; 结核病是严重危害人类健康的慢性传染病之一。据 WHO报道, 2016 年全球结核 病新发病约1 040万例, 130万艾滋病毒阴性患者以及 37.4万艾滋病毒阳
12、性患 者死于结核病, 我国作为全球第三大结核病高负担国家, 新发病例占全球的 8.6%1, 早期发现并接受规范治疗对控制结核病疫情有重要意义。 目前, 结核病的诊断有多种方法, 但都存在一定的缺陷。 细菌学检查是诊断结核 病的“金标准”, 主要包括痰涂片染色观察与痰培养。 传统的痰涂片染色观察阳 性率较低, 对样本质量要求高, 无法区分出非结核分枝杆菌2-3;而痰培养需 长达38 周才能提供结果, 且只能报告分枝杆菌培养阳性4。皮肤结核菌素试 验所使用的结核菌纯蛋白衍生物 (PPD) 含多种分枝杆菌所共有的抗原, 无法区 分BCG 接种和非结核分枝杆菌感染, 造成假阳性较高5;分子检测技术操作
13、复 杂、对检测仪器依赖性要求高、需要专业技术人员, 不适宜用于大样本量筛查 6-7。 另外, 有一些新兴起的结核检测技术, 如生物芯片、 纳米诊断技术、 C-Tb 皮肤试验等8-10, 但尚未应用于临床检测诊断。 结核分枝杆菌抗体检测技术简 便快速, 具有较高的敏感性和特异性, 近年来在临床中被广泛应用, 成为筛查 结核病的主要方法之一。 本文采用敏感性和特异性等指标对一种胶体金免疫层析 法检测结核分枝杆菌抗体 Ig G/Ig M, 用于结核病诊断的应用价值进行评价。 1 材料和方法 1.1 血清样本及其病例背景资料 全部260 例结核病患者血清分别来自 2016年 11月至2017年4月北京
14、市朝阳区 疾病预防控制中心和昌平区结核病防治所收集的病人标本, 其中男性标本 177 例, 女性标本 83例;年龄1086岁, 平均年龄 38.41岁;结核病患者的诊断标准 参照卫生部发布的国标 WS288-2008肺结核诊断标准。72例健康人血清来自 于中国疾病预防控制中心, 均为无结核病病史、无结核病密切接触史、胸部影像 学表现正常的健康志愿者。被检测者均签署了知情同意, 符合医学伦理学要求。 1.2 方法 痰涂片抗酸染色和痰标本分枝杆菌培养, 按照中国防痨协会 结核病诊断实验室 检验规程11标准进行。血清中结核分枝杆菌特异性 Ig G/Ig M抗体检测采用 胶体金免疫层析法。结核分枝杆菌
15、 Ig G/Ig M 抗体检测试剂盒 (胶体金法) 由北 京健乃喜生物技术有限公司生产, 该试剂盒同时使用四种结核分枝杆菌重组抗 原 (6、14、16和38 k Da) 对样本血清进行检测, 操作方法及结果判定严格按 试剂盒说明书的要求进行。 1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析, 计数资料的比较采用 检验, 当 P0.05具有统计学差异。 2 结果 2.1 细菌学检查结果 在收集的260例结核病患者的痰标本中, 细菌学检查结果显示细菌学阴性患者 151例 (58.08%) , 细菌学阳性患者109例 (41.92%) , 其中, 痰涂片阳性患者 49例 (18.8
16、4%) , 痰培养阳性患者 94例 (36.15%) , 痰涂片和痰培养均为阳性 的患者34例 (13.08%) 。 2.2 结核分枝杆菌特异性抗体检测结果 采用胶体金免疫层析法检测血清中结核分枝杆菌特异性抗体 Ig G和 Ig M。临床 诊断为结核病的260 例患者中, Ig G 和Ig M 阳性者分别为104例和 6例, 阳性 率分别为40.00% (104/260) 和2.31% (6/260) , Ig G 和Ig M联合检测结核病 阳性率为41.15% (107/260) 。以细菌学检查结果为标准, 菌阳组中结核病特异 IG和Ig M 阳性率分别为 49.54% (54/109) 和
17、2.75% (3/109) , Ig G 和Ig M 合并阳性率为51.38% (56/109) ;菌阴组中结核病特异 Ig G和Ig M 阳性率分别 为33.11% (50/151) 和1.99% (3/151) , 结核病特异性 Ig G和Ig M 合并阳性 率为33.77% (51/151) 。菌阳组特异性Ig G/Ig M 抗体阳性检出率高于菌阴组 (=8.098, P0.05) 。在健康对照组中, 采用胶体金免疫层析法检出阳性 6例, 阳性率为8.33% (6/72) , 如表1所示。胶体金免疫层析法检测血清中抗结核分枝杆菌特异性抗体的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为 4
18、1.15% (107/260) 、91.67% (66/72) 、94.69% (107/113) 和30.14% (66/219) 。 表1 结核分枝杆菌抗体 Ig G/Ig M检测结果 Tab.1 Results of Mycobacterium tuberculosis Ig G/Ig M antibodies detection 下载原表 2.3 不同检测方法结果比较 同时采用痰涂片法、痰培养法和结核分枝杆菌抗体 Ig G/Ig M法对260 例结核病 患者样本进行检测, 阳性率分别为18.84%、36.15%和41.15%, 结核分枝杆菌抗 体Ig G/Ig M 检测阳性率明显高于痰
19、涂片法和痰培养法 (2=8.105, P0.05;2=7.321, P0.05) 。痰涂片法和痰培养法联合检测阳性率为 41.92%, 结核抗体检测法同痰涂片法联合检测阳性率为 48.85%, 同痰培养法联合检测阳 性率为58.46%, 结核抗体检测、痰涂片法和痰培养法三种方法联合检测阳性率 为61.54%, 见表2。 表2 不同方法及其联合对 260例样本的检测结果 Tab.2 Detection results of 260 cases with different methods and combinations 下载原表 表2 不同方法及其联合对 260例样本的检测结果 Tab.2 D
20、etection results of 260 cases with different methods and combinations 下载原表 3 讨论 结核病早期症状、 体征不明显, 通过传统的细菌学检测进行诊断, 敏感性低, 漏 检率高, 对于无痰、 涂阴或培阴的病人诊断难度更大, 尤其是细菌培养耗时很长 (出结果需38周) 。近几十年, 结核分枝杆菌抗体检测在临床上得到了广泛的 应用, 这其中胶体金免疫层析法检测结核分枝杆菌抗体可以在半个小时内读取 结果, 适合结核病的筛查。 本研究所用结核分枝杆菌抗体检测试剂盒, 同时采用 四种结核分枝杆菌重组抗原, 分别是6、14、16、38
21、k Da。6k Da早期分泌性蛋 白 (ESAT-6) 在检测结核感染者方面具有高度的特异性, 但研究表明结核患者 血清中抗ESAT-6抗体含量低, 单独作为结核病血清学诊断试验意义不大, 可作 为结核病血清学诊断的组合抗原之一12。14k Da抗原在感染初期就具有明显 的免疫原性, Sumi 等用该抗原免疫兔子获得相应抗血清, 使用斑点免疫结合试 验 (Dot-Iba) 检测结核病患者脑脊液中的循环抗原, 特异性和敏感性均较好13。16k Da抗原的编码基因 Rv2031仅存于结核分枝杆菌复合群, 可以帮助结 核菌在宿主体内存活, 对结核菌的潜伏感染有重要作用14。38k Da 抗原是结 核
22、分枝杆菌积极分泌的抗原, 其表达量是BCG 中合成量的10倍, 研究表明 38k Da具有较高的抗原特异性和免疫反应性, 单项诊断结核病的效果优于其他单一 抗原, 有很好的应用前景15。 试剂盒采用了基因工程制备的上述几种结核抗原 和胶体金免疫层析技术, 定性检测血清中结核分枝杆菌 Ig G和Ig M 抗体, 检测 时样本中的结核分枝杆菌抗体可与胶体金标记的抗原形成结核抗体-金标抗原复 合物, 与硝酸纤维膜上包被的抗体或抗原结合而显色。 本研究通过采用胶体金免疫层析检测方法检测 332例样本, 结果显示结核分枝 杆菌抗体检测结核病患者敏感性为 41.15%, 特异性为91.67%。 与传统的痰
23、培养、 痰涂片检测结果相比, 胶体金检测方法的阳性检出率明显提高, 用于结核病的 辅助诊断可增加临床中结核病的检出率。在国内外研究中, Mathai 等对五种不 同的免疫检测试剂盒进行评价, 灵敏度从 46%到 68%不等16, 夏强等研究表明, 结核抗体Ig G/Ig M 检测结核病患者的敏感度为 74.51%, 特异度为91.64%17, 本研究的结果显示, 胶体金检测技术检测血清中结核分枝杆菌抗体的敏感性略 低于上述既往报道, 其主要原因可能与感染结核分枝杆菌后产生的不同种类抗 体浓度以及病程有关18, 本研究中大部分标本来源于复诊患者或处于不同治 疗阶段的已治疗患者, 造成结核分枝杆菌
24、特异性抗体浓度低于试剂盒的检测极 限, 出现阴性结果, 导致灵敏度下降。另外, 引起免疫应答的抗原性比较复杂, 不同抗原会导致不同个体呈现出不同的抗体谱19, 仅使用几种抗原进行检测 会造成漏诊。在结核分枝杆菌感染早期, 患者体内免疫球蛋白以 Ig M 型结核抗 体为主, 中晚期以 Ig G型为主, 而在潜伏感染者及感染愈后患者体内一定时期 内存在大量Ig G抗体。本研究中抗体 Ig M 阳性患者仅有6例, 大部分检测出 Ig G阳性, 提示大多数患者均非感染初期患者, 这与标本的背景资料相符。与 单独的细菌学检测结果及某一特定的抗体检测结果相比, 抗体Ig G 和Ig M联合 检出率比单独检
25、出率显著提高。Ig M抗体检测可以补充 Ig G检测只针对结核病 中晚期的局限性, 为结核病的早期诊断提供了依据, 针对不同的患者, 不同的 病程, Ig M 抗体的检测在结核病的诊断中同样具有重要意义。 结核分枝杆菌Ig G/Ig M 抗体检测痰细菌学阳性患者和阴性患者的敏感性分别为 51.38%和 33.77%, 菌阳性样本敏感性高于菌阴性, 二者差异具有显著统计学意 义 (P0.05) 。本研究结果显示, 在109例菌阳标本中检出 56例阳性, 痰细菌 学检查是肺结核活动期的重要指标之一, 表明在活动期结核抗体的检出率明显 增高。菌阴性样本共 151例, 检出51例阳性, 敏感性低于菌阳
26、结核病患者, 但 其更具有诊断价值, 菌阴性结核病的诊断缺乏金标准, 只能通过影像学、 临床症 状、抗结核治疗、免疫学检测、病理学检测和分子生物学检测等方法的结果进行 综合性判断, 结核分枝杆菌抗体检测为菌阴性肺结核的诊断提供依据, 具有重 要的临床意义。 阳性预测值和阴性预测值可以用于评价一个方法在临床的诊断价 值20。在结核病高流行区, 阳性预测结果高, 有利于临床可疑病例的诊断;在 结核病低流行区, 阴性预测值高, 有助于排除结核病21。 本研究结核患者结核 抗体Ig G/Ig M 胶体金检测技术的阳性预测值为 94.69%, 我国作为结核病高流 行国家22, 胶体金免疫层析法检测结核分
27、枝杆菌抗体阳性预测值高, 具有对 临床可疑病例更高的辅助诊断价值。 结核分枝杆菌抗体 Ig G/Ig M胶体金检测、痰涂片、痰培养三种方法的阳性率分 别为41.15%、18.84%和36.15%。结核抗体检测阳性率高于痰涂片法和痰培养法。 痰细菌学检验所需标本的采集过程十分关键, 标本的质量直接影响检验结果, 低质量的标本可能会造成漏诊或误诊。 随着临床诊断技术的不断发展, 血清结核 分枝杆菌抗体检测在结核病的检测中使用较多, 该方法不会受到痰标本采集不 规范或患者无痰的影响, 在临床诊断中, 医务人员可联合痰细菌学检测和结核 分枝杆菌抗体检测进行检验, 充分发挥这两种方法的优势, 进一步提高
28、患者检 出率。 本研究结果表明, 结核分枝杆菌抗体检测同痰细菌学检测方法联合检测可 大幅度提高阳性检出率, 结核抗体检测、 痰涂片法和痰培养法三种方法联合检测 阳性率为61.54%。阳性检出率的提高意味着更多的结核病患者能够被检出, 得 到及时的治疗, 从而降低结核病的传播率。 胶体金免疫层析法结核分枝杆菌抗体检测耗时短, 成本低, 操作简便, 适合大 样本量的筛查;但其有一定的假阳性和假阴性, 有报道显示, 结核抗体检测敏感 性约为10%90%, 特异性约为 47%100%, 不同研究使用不同试剂和方法之间有 很大的差异23。2008 年, WHO对来自不同国家的 19种及合并血清学快速诊断
29、 试剂盒产品进行评估, 在参评的这19种试剂盒中, 与痰培养相比, 检测灵敏度 为1%60%, 特异度为 53%99%, 不同试剂盒间差异较大, WHO认为现有的血清学 诊断试剂的敏感度和特异度都有待进一步提高, 不推荐其作为一种快速诊断的 方法在临床中肺结核和肺外结核的诊断24。 因此, 该检测可作为辅助诊断, 配 合痰细菌学、 影像学和临床表现等, 提高结核病的检出率, 协助早期诊断, 指导 临床制定有效治疗方案, 改善结核病患者预后。尤其是对临床症状不典型、细菌 学检测阴性的患者的诊断, 具有一定的临床诊断价值。 但是血清学检测结核分枝 杆菌抗体也有其局限性, 结核分枝杆菌抗原的选择、
30、纯化等方面有待提高, 多种 抗原联合检测有望提高血清学检测方法的敏感性和特异性。 参考文献 1WHO.Global tuberculosis report 2017M.Geneva:World Health Organisation, 2017. 2Wang CY, Li YR.The analyses of 3479 sputum specimens of acid-fast bacillus of pulmonary tuberculosis patientsJ.J Clin Pulmon Med, 2004, 9 (6) :605-606. (in Chinese) 王成勇, 李益荣.3
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