1、实验 17 蛋白质含量测定（双缩脲法）一、目的 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。掌握分光光度计的使用方法。 二、原理 碱性溶液中双缩脲（ NH 2 一 co 一 NH 一 co 一 NH 2 ）能与 Cu 2 + 产生紫红色的络合物，这一反应称为“双缩脲反应” 。蛋白质分子中的肽键也能与铜离子发生双缩脲反应，溶液紫红色的深浅与蛋白质含量在一定范围内符合朗伯一比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子质量无关。其可测定范围为 1- l0mg 蛋白质，适用于精度要求不高的蛋白质含量测定。 Tris ，一些氨基酸， EDTA 等会干扰该测定。 三、仪器、试剂和材料 1 仪器 （ 1) 分光光度计
2、 （ 2 ）分析天平 （ 3 ）振荡机 （ 4 ）刻度吸管： 1m1X2 ， 5m1X2 ， 10m1 X 1 (5 ）具塞三角瓶： 1OOml （ 6 ）漏斗： 13 个 2 试剂 （ 1 ）双缩脲试剂：取硫酸铜（ Cu S0 4 5H 2 O ） 1.5g 和酒石酸钾钠（ NaKC 4 H 4 O 6 .4H 2 O ） 6.0g ，溶于 500m1 蒸馏水中，在搅拌的同时加入 300m1 10% NaOH 溶液，定容至 1000 ml ，贮于涂石蜡的试剂瓶中。 （ 2 ） 0.05mol/L 的 NaOH 。 (3) 标准酪蛋自溶液：准确称取酪蛋白 0.5g 溶于 0.05mol/ L
3、的 NaOH 溶液中，并定容至 100m1, 即为 5mg/m1 的标准溶液。 3 材料 小麦、玉米或其他谷物样品，风干、磨碎并通过 100 目铜筛。 四、操作步骤 1 标准曲线的绘制 取 6 支试管，编号，按下表加入试剂： 管号 试剂 1 2 3 4 5 6 标准酪蛋白溶液（ ml ） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 H 2 O （ ml ） 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 双缩脲试剂（ ml ） 4 4 4 4 4 4 蛋白质含量（ mg ） 0 1 2 3 4 5 震荡 15min ，室温静置 30min ， 54Onm 比色，以蛋白质含量（ mg ）为横坐标，吸光度
4、为纵坐标，绘制标准曲线。 2 样品测定 （ 1 ）将磨碎过筛的谷物样品在 80 下烘至恒重，取出置于燥器中冷却待用。 （ 2 ）称取烘干样品约 0.2g 两份，分别放入两个干燥的三角瓶中。然后在各瓶中分别加入 5ml 0.O5mol L 的 NaOH 溶液湿润，之后再加入 20ml 的双缩脲试剂，震荡 15min ，室温静置反应 30min ，分别过滤，取滤液在 540nm 波长下比色，在标准曲线上查出相应的蛋白质含量（ mg ） 。 从标准曲线上查得的蛋白质含量 (mg ) 五、结果处理 六、注意事项 1 三角瓶一定要干燥，勿使样品粘在瓶壁上。 2 所用酪蛋白需经凯氏定氮法确定蛋白质的含量。 七、思考题 双缩脲法测定蛋自质含量的原理是什么？
