1、武汉大学分子遗传学笔记(不断更新中 ) 第一章 绪论 1.1 分子遗传学的含义 1.不能把分子遗传学单纯地理解成中心法则的演绎 *分子遗传学 中心法则 传统：分子遗传学= 中心法则 实际：分子遗传学中心法则，首先是遗传学，其坚实的理论基础仍然是摩尔根的基因论中心法则只是对基因，性状及突变在核酸分子水平上的解释。从中心法则到性状的形成仍然是一个复杂的甚至未知的遗传，变异与发育的生物学过程。分子遗传学不仅盯住 DNA/RNA，蛋白质，更要研究活细胞内与遗传便宜有关的一切分子事件。 *分子遗传学 核酸+ 蛋白质 分子遗传学研究的对象是分子水平上的生物学过程-遗传与变异的过程。它研究的是动态的生物学过
2、程，而不是脱离生物体，在试管里孤立地研究生物大分子的结构与功能。 1992 年， Nature 的主编 J.Maddox 曾著文 Is molecular biology yet a science？指出：“现在有那么一些叫分子生物学家的人，他们的文章无视全部的动物，植物，也很少言及他们的生理学。实验的大部分资料来自所谓的凝胶-分子生物学在很大程度上变成定性的科学。-如果事情只是简单的说明某个基因版本与某种遗传病相关，那么，分离这种片段（如电泳） ，然后测序足以。但是以往的巨大成就表明，生命过程是由严格控制下进行的一些有序事件组成。他说：在人们长期为细胞生物学现象寻找定性的解释中，他们将会相信
3、细胞只不过是一个充满了分子开关的袋子，他们作为分子传动器或开或关而出现在预定的事件序列中。要真正在分子水平上了解遗传变异的本质，仅仅研究核酸或蛋白质的生物化学是不够的。分子遗传学所研究的应该是细胞中动态的遗传变异过程，以及与其相关的分子事件。所以不止是中心法则，核酸，蛋白质。 2.分子遗传学不是核酸及其产物（蛋白质）的生物化学 分子遗传学是分子生物学的一个分支，或理解为狭义的分子生物学。他依照物理，化学的原理来解释遗传现象，并在分子水平上研究遗传机制及遗传物质对代谢过程的调控。因此，分子遗传学是在生命信息大分子的结构，功能及相互关系的基础上研究遗传与变异的科学。3.传统的遗传学主要研究遗传单元
4、在各世代的分布情况，分子遗传学则着重研究遗传信息大分子在生命系统中的储存，复制，表达及调控过程。研究范畴如下：DNA RNA Protein 现象 信息源 信息模板 工作分子 生长、分化、发育、代谢 1.2 分子遗传学的产生 1.物理学的渗透1945 年奥地利物理学家量子力学的创始人之一薛定谔（ERWIN SCHRMODINGER）的生命是什么一书出版。倡导用物理学的思想和方法探讨生命的秘密。引入热力学第二定律，熵概念等。他认为有机体在不断地增加他的熵并趋向最大值的熵的危险状态，那就是死亡。要摆脱死亡而正常生长发育，就要从环境中吸取负熵，负熵是一个积极的东西。有机体就是依赖负熵为生的。他认为生
5、命系统中可能还包含迄今未知的“其他的物理学定律“ 极大地鼓励 着很多物理学家转入生物学来研究基因的本性。整个 40 年代，新的物理学定律并未发现，但信息论，量子论，氢键等概念把生物学推向分子水平。 2.微生物学向遗传学的靠拢1926 年摩尔根的基因论已经问世，但 20 世纪 30 年代，微生物学家采用拉马克的遗传观念，因为他们对微生物的遗传可塑性有很深刻的印象。如在含有致死药物的培养基上，可以很容易培育出各种致死药物有抗性的微生物品系；把不能利用乳糖的微生物放在乳糖为主要营养的培养基上，可以培育出利用乳糖的新品种。似乎人们所期望的微生物的任何变异都能通过适当的培养而产生出来，这使人们容易相信培
6、养基中的物质可以引起微生物遗传结构的定向变异。 事实并非如此，40 年代抗生素的大规模使用，发生了病原菌的抗药性问题。实验表明，病原菌的一种抗药性在没有该药存在的情况下随机地发生了。说明抗药性的产生并不是由于微生物在某种药物的作用下的后天获得性遗传，而是随机发生的自发突变经过药物的筛选作用，使不具有抗药性的菌体死亡，使具有抗药性的变异菌体大量繁殖起来。于是，拉马克倒了，人们转向摩尔根的基因突变理论。3.生化遗传学的出现近代遗传学的基础已经稳固建立，开始研究基因是怎么发生作用的问题。生物化学家自然把性状的差别与不同的生化反应联系起来，把支配性状的基因与控制生化反应的酶联系起来。 1923 年英国
7、人加罗德（GARROD ） ，人类的尿黑酸尿症是一种隐性遗传病。当这种纯合隐性基因存在时就不能产生尿黑酸酶，使尿黑酸（蛋白质的代谢产物）不能最终分解为二氧化碳和水而积累于血液中。表明基因通过酶合成的控制而影响遗传性状的发育。 4.从生化遗传学到分子遗传学 基因与酶（蛋白质）的对应性，使人们想到了基因在遗传信息上与其产物相关。 三个重要发现更促成了生化遗传学向分子遗传学的转变： 40 年代解决了遗传的物质基础问题 1928 年 F Griffith，肺炎球菌 1944 O T Avery 肺炎球菌遗传物质转化 50 年代确定了分子水平上的遗传机理问题 1953 J Watson F Crkck
8、DNA 分子的双螺旋模型 碱基配对原则 60 年代解决了遗传密码问题 1955 F Sanger 胰岛素氨基酸序列确定 1958 F Crick 提出中心法则 1967 年“遗传密码字典“问世 1.3 分子遗传学的展望 1.基因的概念一门科学都是以概念为基础的。 化学以原子-分子概念为基础，而遗传学则是以基因概念为基础。 基因概念的演变标志着遗传学的发展。什么是基因？摩尔根在基因论中提出遗传粒子理论，整个基因论是以粒子性的基因彼此独立互不重叠。好象线上的连珠。 分子遗传学的发展证明基因不仅可以重叠，而且可被分隔。为此，GILBERT 1978 年提出“基因是转录单位“代替了“基因是功能单位“的
9、概念。仍然有些不妥，因为有的基因（如启动子基因或操纵子基因）并不转录或不完全转录，而作为一个单位转录下来的 MRNA 也往往不是一个基因。 以前认为基因是染色体上成直线排列的独立单位，现在发现一些相关的基因在染色体上的排列不是杂乱无章的，而是构成一个小的“家族“或基因群。 基因及基因型的稳定性一直是传统遗传学的重要概念，而 1952 年 MCCLINTOCK 在玉米中发现了转座子即跳跃基因。30 年后的 1983 年她为此获得诺贝尔奖金。 2.真核细胞的基因调控原核生物的操纵子模型比较彻底地了解原核生物的基因调控。但操纵子模型对真核生物不适用。因为：这一简单的基因调控模型无法解释高等生物体中复
10、杂性状的分化与发育过程。这种模型的调控灵敏度 MRNA 很快地被制造又很快地被消耗能够对外界的生存条件作出快速反应，而真核生物中 MRNA 的半衰期很长。真核生物许多协同作用的基因是分散在若干不同的染色体上，而原核生物只有一条染色体。因此真核生物的调控过程是分子遗传学的一项战略性任务。 3.遗传与发育遗传和发育的研究“分久必合“。 阐明基因对发育中的个体如何发生作用？这将会进一步扩大遗传学的观念。发育过程中基因通过怎样的调控系统参与分化的？这些基因活动形式的发生与遗传的分子机制是什么？随着分子遗传学的发展，或许会出现基因发育学。 将来通过遗传物质的分子活动能控制生物的发育分化吗？能否控制生男生
11、女，体质和容貌吗？能否消灭遗传病，癌症？ 1997 年 “克隆羊“（Dolly）的诞生，由分化的体细胞发育出来的后代。 4.自我组合过程生物的遗传与发育过程就是一个自我组合过程。将 T4 的各个部件混于溶液中，它们将会自动地装配成完整的 T4。 5.遗传工程遗传工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学，微生物遗传学的手段来改造或重组生物遗传特性的一门新技术。主要指基因重组技术。 遗传工程在实际应用上有着巨大潜力。DNA 扩增技术大量地生产细胞中产量极微而又具有极大应用价值的基因产物如胰岛素，生长激素，干扰素等。基因的重组与转化主要以大肠杆菌，酵母以及培养细胞为受体，而遗传工程的一个引人注目的
12、发展是试图在整体动物或植物之间进行基因转移，真正改造生物的遗传性状或治疗人类的遗传疾病。超级小鼠的问世。 真核生物的基因组极其庞大。在整体情况下研究某一基因，常因条件错综复杂而难以分析。重组 DNA 技术使我们可以把需要的基因分离出来，对其进行重组和改造，或把他放回严格控制的细胞中去研究基因的结构和功能，或获取理想的蛋白质产品。 近年来的蛋白质工程，应用基因重组技术去改造蛋白质分子结构，修改蛋白质的 DNA 编码，创造出新的蛋白质。 6.基因组计划人类基因组计划（human genome project HGP） 在全世界以深为人知，这应该是当今生命科学中最重大而热门的课题。人类基因组计划的最
13、主要的目的是解读人类基因组的正常结构，功能，及基因的异常与人类疾病。 并由此会带来巨大的经济效益。这项计划是从 1987 年主要在美国以全基因组 DNA 测序为目标开始进行的（1990 年正式启动） 。已耗资 300 亿美元并将接近完成 第二章 遗传物质的基础DNA 的结构与性质 2.1 核酸是遗传物质 遗传物质这种特殊的分子必须具备以下基本特点：1.稳定地含有关于有机体细胞结构，功能，发育和繁殖的各种信息 2.能精确地复制，这样后代细胞才能具有和亲代细胞相同的信息 3.能够变异，通过突变和重组生物才能发生改变，适应和进化 遗传物质的发现1928 年英国 F Griffith 的肺炎球菌转化实
14、验导致了遗传物质的发现。十年后 O Avery 的体外转化实验弄清了这种转化因子的化学本质是 DNA，而不是蛋白质或其他的大分子。 1952 年 Hershey-Chase 的实验使遗传物质的结论得到了进一步的证实，而于 1969 年获得了诺贝尔医学生理学奖。 RNA 也是遗传物质：如烟草花叶病毒的遗传物质是 RNA。 2.2 DNA 携带两类不同的遗传信息DNA 几乎是所有生物的遗传信息的携带者，除开少数 RNA 病毒之外。 DNA 携带着两类不同的遗传信息：一类是负责蛋白质的氨基酸组成的信息，以三联体密码子进行编码；另一类遗传信息是关于基因选择性表达的信息 2.3 DNA 和 RNA 的化
15、学组成及双螺旋模型 1.DNA 和 RNA 的化学组成 核酸包括 DNA 和 RNA。经水解成单核苷酸（nucleotides） ，单核苷酸由磷酸基团（phosphate group）和核苷（nucleotide）组成，核苷含有戊糖（pentose）和碱基（base ） 。DNA 中戊糖是 D-脱氧核糖，碱基是 ATGC；而 RNA 中戊糖是 D-核糖。碱基是 AUGC。 2.DNA 双螺旋模型的诞生 美国 J D Watson 在芝加哥大学读本科时对鸟类感兴趣，到了高年级时，他想了解基因是什么。1949 年他带着这种想法进入了剑桥大学卡文迪实验室医学研究组，与物理出生的青年学者 F Cric
16、k 合作，决定研究 DNA 的分子结构。Crick 在 1946 年读了薛定谔（E Schrodinger）的名著（生命是什么）后，舍弃物理学转向生命科学领域。刚到剑桥大学时Watson 由于自己的化学与物理学基础较差而担心听不懂 R Franklin 所做的关于 DNA X-衍射的研究学术报告，而两年后（1953 年）他与 Crick 却建立了 DNA 分子的双螺旋模型，论文虽然很短，却是划时代的发现。可以说是孟德尔定律之后，在遗传学和分子生物学领域中最伟大的发现。因此，人们将这一发现看成是分子遗传学的起点。没有双螺旋就没有现在的基因工程，就没有分子生物学的迅猛发展。这一模型是生物学与物理学
17、，结构化学交叉融合的结果。尽管 FRANKLIN 和 WILKINS 在 DNA 的 X 衍射研究方面非常突出，但却未能提出 DNA 的结构模型，就因为他们缺乏生物化学方面的知识。但没有他们的工作，WATSON 和 CRICK 建立的模型也不能及时得到验证。1951 年 WATSONG 去英国进修生物化学。 双螺旋的建立是建立在前人科研成果的基础上的主要是四个影响： a.WT Astury 和 Bell X 衍射技术研究 DNA。 1947 年拍摄了第一张 DNA 的衍射照片。 b.1951 年 Pauling 和 Corey 在美国科学院报上连载了 7 篇有关 a-螺旋结构的文章轰动了全世界
18、，引起了 Watson 和剑桥科学家们的注意。 c.美国晶体学者 J Donohue 的指正和 Chargaff 的当量规律都帮助 Watson-Crick 纠正了 起初 A-A G-G C-C T-T 的同类配对的错误想法。而提出碱基互补的正确构型。 d.R Franklin 和 Wilkins 在 1952 年底拍得了一张十分清晰的 DNA 结晶 X 衍射照片。为双螺旋结构模型提供了强有力的依据和佐证。他们把数据整理好后与“DNA 双螺旋结构“ 一文同时发表，因此 J K Watson，Crick ，Wilkins 分享了 1962 年的诺贝尔奖，可惜的是 FRANKLIN 1958 年就
19、英年早世未能享受这一最高荣誉。 3.双螺旋模型的特点DNA 双螺旋模型有以下特点： a.DNA 分子由两条反向平行的多核苷酸链组成，形成右手双螺旋，即从一端看过去，是以顺时针方向旋转。 b.双螺旋的直径是 2nm；螺距为 3。4nm，上下相连的碱基的垂直距离为 0。34nm，交角为36 度，每个螺旋有 10 个碱基对。 c.两条链反向平行即两条链的 5和 3的方向相反。 d.糖-磷酸键是在双螺旋的外侧，两条链上的碱基通过氢键形成碱基对，使两条链在一起。 e.糖与附着在糖上的碱基近于垂直。 f.碱基配对为嘌呤对嘧啶。 g.DNA 双螺旋有大沟（major or wide groove）和小沟（m
20、inor or narrow groove）的存在 2.4 DNA 的结构和性质 1.DNA 的一级结构DNA 结构是由脱氧核糖核酸通过 3，5磷酸二酯键连接而成的高聚物。DNA 的一级结构是指核苷酸在 DNA 分子中的排列顺序。DNA 的一级结构的测序工作进展很快。1975 年 Sanger 提出新的测序策略。 酶法：Sanger 加减法 末端终止法（双脱氧法） 化学方法： Maxam Gilbert 化学断裂法（硫酸二甲酯，肼） 2.DNA 的二级结构 双螺旋结构模型的特点(见上一节） DNA 双螺旋的种类（DNA 二级结构多形性）：1953 年 Watson and Crick 提出的
21、DNA 右手双螺旋模型属于 B 型双螺旋。除 B 型构象外，还存在有 A，C，D，E 等构象的右手双螺旋构象以及 Z 构象左手双螺旋。B-DNA 与 Z-DNA DNA 类型 每一螺旋的碱基对数 每对螺旋的碱基对数 碱基对间的距离(nm) 螺旋直径(nm) B 10 右旋 36 度 0.338 1.9-2.0 Z 12 左旋 30 度 0.371 1.8 Z-DNA 与染色质的结构及功能的关系 a.与染色质结构的关系 SV40 基因组中三个潜在的 Z-DNA 区段处于不能形成核小体的区域，说明 Z-DNA 构象与核小体结构的形成有关b.与基因活性的关系 与基因转录活性的调控有关 Z-构象的研究
22、意义：1979 年 AHJ WANG 发现六聚体 D(CpGpCpGpCpGp) 决定双螺旋结构状态的因素（维系该结构的力） 氢键 碱基堆集力 带负电荷的磷酸基的静电斥力 碱基分子内能3.DNA 物理结构的不均一性 反向重复序列(inverted repeats)：又称回文结构 Palindrome (图示) 富含 A/T 的序列 嘌呤和嘧啶的排列顺序对双螺旋结构稳定性的影响(图表) 4.DNA 的变性，复性，杂交 , Cot 曲线 1) 变性 变性的方法，测量变性的方法：光吸收法，增色效应 2) 复性 复性条件，复性机制 3) 杂交 杂交原理及程序 图示4) Cot 曲线 DNA 复性的二级
23、方程 5.DNA 超螺旋和拓扑异构现象(略) 6.常见的 DNA 分子形式及其相互关系( 略) 3.2 真核生物 C 值矛盾 同一物种的基因组 DNA 含量总是恒定的，一个单倍体基因组中的全部 DNA 量称为该物 种的 C 值。 不同物种的 C 值也不同。最小的支原体为 104bp，而最大的两栖类或某些显花植物可 达1011bp。后者比人类高出几十倍，这无法让人理解，这种形态学复杂程度与 C 值大小不一致的 C 值反常现象称为 C 值矛盾。 有待回答的几个问题： 位于基因内 DNA 成分（包括转录而不翻译的区域，如内含子以及编码序列的两翼序列）究竟占基因组的多大比例？这些基因中有多少是必需基因
24、？多少是非必需基因？非基因 DNA成分的功能是什么？基因组 DNA C 值的巨大差异对基因组的活动和功能究竟有什么影响 3.3 原核生物染色体及其基因 原核生物和真核生物比较 第二节 基因组大小与 C 值矛盾 第三节 原核生物染色体及其基因 第四节 真核生物的染色体 第五节 真核生物的基因 第六节 基因定位 第七节 基因的分子进化 第八节 早期生命进化的三界系统理论 3.5 真核生物的基因 1.真核生物基因组的一般特点 真核生物的基因组一般比较庞大，远大于原核生物的基因组。 真核生物的 DNA 与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内。 真核基因组存在着许多重复序列，重复次数可达几百万以上。 绝
25、大多数真核生物编码蛋白质的基因为断裂基因，即结构基因是不连续排列的，中 间由插入序列隔开。 真核生物基因组中不编码的区域多于编码区域。 真核生物不仅含有核内染色体 DNA，还有核外细胞器 DNA、核外细胞器有线立体 DNA 和叶绿体 DNA。 2.断裂基因（不连续基因） interrupted or discontinuous genes SV40A 蛋白基因含有一段 346NT 的间隔区。每个活性珠蛋白基因含有两个间隔区。 卵清蛋白基因含有 7 个插入序列被分成八段。 3.基因家族与基因簇 gene family & gene cluster 定义：真核生物基因组中许多来源相同，结构相似，功
26、能相关的基因在染色体上成 串存在，这样的一组基因称为基因家族。多基因家族是真核生物基因组织的一个重要特征。 多基因家族在基因组中的分布情况不同，有些基因成串排列集中在一条染色体上， 集中成簇的一组基因形成基因簇。也称串联重复基因（见后） 。如组蛋白基因, rRNA 基因, tRNA 基因等。而有些基因家族成员不集中排列，而是分散在基因组的不同部位。如干扰素，珠蛋白，生长激素，SOX 基因家族。 在多基因家族中，有些成员不具有任何功能，这类基因叫假基因(pseudogene)。 4.串联重复基因 特征： A. 各成员间有高度的序列一致性或完全相同。 B. 拷贝数高，几十个至几百个。因其在细胞中的
27、需要量很大。 C. 非转录的间隔区短而一致。 组蛋白基因 五种组蛋白基因彼此靠近构成一个重复单位。许多这样的重复单位串联在一起，构 成组蛋白基因簇。 rRNA 基因 原核生物有三种 rRNA：5S，16S，23S 真核生物有四种 rRNA：5.8S,18S,28S, 5S 主体 rRNA：三种主体 rRNA 基因组成重复单位，转录出一个 45SrRNA，经转录后处理切除间隔区成为 18S，5.8S ，28S 三种 rRNA。 核仁：核中 rRNA 基因大量地转录成 RNA，由于其染色性质与 DNA 不同，在光学显微镜下形成特殊的区域，这一结构，称为核仁（nucleole） 。含有 rDNA 串
28、联重复单位的染色体称为核仁组织者（nucleoolar organizers） 。 tRNA 基因 tRNA 长约 70-80bp，其基因约长 140bp。TRNA 也是串联重复排列，但个重复单位中各个 tRNA 基因可以相同可以不相同。 5.细胞器基因 真核生物细胞器中有两类细胞器能够携带遗传物质。 动物生殖细胞中只有卵子才有线立体基因，而精子缺乏。线立体 DNA 多为环状非重复DNA 序列。属于核外 DNA。 线粒体和叶绿体均编码自身所需的某些蛋白质以及 tRNA 和 rRNA，其余均由核基因编码。 细胞器有自己的蛋白质合成器。只有两种 rRNA。哺乳为 12S 和 16S，酵母为 18S
29、 和21S（含有一内含子） 。tRNA 比核内编码的 tRNA 小。酵母 DNA 为 84kb。其上面的基因有三个特点。 哺乳动物线立体 DNA 不同于酵母。人体线立体基因排列非常紧密。人类线立体 DNA为 16.569kb。含 37 个基因；13 个蛋白质基因；1 个 cytb 基因；2 个 ATP 酶亚基基因；3个 CO 亚基基因（细胞色素氧化酶亚基） ；7 个 NADH 脱氢酶亚基基因；2 个 rRNA 基因：12S rRNA、16S rRNA；22 个 tRNA 基因 3.4 真核生物的染色体 真核生物 DNA 复性动力学 真核生物染色体上的单一序列和重复序列以及卫星 DNA 单一序列
30、又称非重复序列 轻度重复序列 中度重复序列 高度重复序列 卫星 DNA 的等级结构及其起源和进化 染色质和核小体 染色质 chromatin 核小体 nucleosome 着丝粒 centromere 端粒 telomere 第四章 DNA 复制、转录与翻译 4.1 DNA 复制 一. DNA 的半保留复制 Watson &Crick 最早提出 DNA 的半保留复制机制。即是：DNA 分子的双螺旋在复制时分开，各自作为新链合成时的模板，复制后，每一个新的双链 DNA 分子都是由一条亲链和一条新合成的子链组成的。合成过程中亲链和子链间严格的碱基配对是 DNA 复制的基础。 图示 DNA 复制（M
31、eselson-Stahl 实验Cscl 超离心显示不同比重 DNA 带） 二. 复制原点，方向和方式或 DNA 复制是从特定的位点开始并按特定的方向进行 实验证明，DNA 分子复制时不是随机起始的，而是从特定的位点开始的，这一特定的位点叫做复制起始点或复制原点，常用 ori 或 o 表示。 许多生物的复制点都是 DNA 呼吸作用强烈的区段， 即是经常开放的区段（frequently opening region ）亦即富含 A，T 的区段。这一区段产生瞬时单链与 SSB 蛋白（single-stranded DNA binding protein）结合，对复制的起始十分重要。复制从特定的位置
32、开始，大多数双向进行，也有一些单向的或以不对称的双向方式进行。 在复制原点双链 DNA 解旋形成复制叉。在复制叉处，新合成的子链 DNA 以各自的亲链为模板，总是从 5-3方向合成。复制叉是不对称的，即两条新合成的链中，一条链是连续合成，叫前导链（leading strand ） ，另一条链是在模板 DNA 指导下，通过一个叫 DNA 引发酶的蛋白质，在特定的间隔区先合成大约 10 个 NT 的 RNA 引物为 DNA 聚合酶提供 3OH，然后合成一个称之为冈崎片段的不连续的 DNA 片段，再经专门的 DNA 修复系统，去除 RNA 引物，再经 DNA 连接酶通过磷酸二酯键将其连起来，完成该子
33、链的合成，这一条链叫后随链（lagging strand） 。依 据 D N A 合 成 的 起 始 方 式 ，复制分为两种类型：复制叉式（包括复制）和滚环式复制又叫复制。 三. DNA 复制的酶学 是一个复杂的酶学过程，需要 30 多种酶而后蛋白质的参与，构成复制体（ replisome） 1. DNA 聚合酶及其聚合反应 DNA POL 是指以脱氧核苷三磷酸为底物催化合成 DNA 的一类酶，其催化反应为： DNApol.DNA-OHDNA-（pdN ）n +n ppi dNTP Mg2+ 这一原理被应用于现代技术中如 PCR 中的 Tag 酶作用机理。 所有真核生物和原核生物都有几种 DN
34、A 聚合酶，这些聚合酶协同作用负责染色体 DNA 的复制，DNA 分子的修复，核 DNA 的重组以及染色体外DNA 的复制。 原核生物有三种 DNA 聚合酶，即 Pol I，Pol II，Pol III，Pol III 是 DNA 复制的主酶。 真核生物有五种 DNA 聚合酶，即， ， ， ， 。 ， ，是复制主酶，是核 DNA 复制的重要酶。 2. 脱氧核苷三磷酸前体的来源 有两个来源：废物利用体内核酸降解或直接来自培养基 新合成途径利用生物体的氨基酸，CO2，NH3 和磷酸核糖焦磷酸合成核 糖核苷单磷酸（NMP） 核苷单磷酸激酶 NMP + ATP NDP + ADP 核糖核苷酸还原酶 N
35、DP dNDP 脱掉核糖 2上的氧 核苷二磷酸激酶 dNDP + ATP dNTP +ADP （dNTP：四种脱氧核糖核苷酸） 所有生物的核酸链的合成都是按 53方向进行的，无一例外。 3. 三种 DNA 聚合酶的结构和功能 4. DNA 连接酶 DNA Pol 虽能填充缺口，但不能使缺口接合，而连接酶则能完成接合任务。 5. 与 DNA 几何性质有关的酶 螺旋酶（helicases） 又称解旋酶，使双链 DNA 分离: C. 螺旋酶 I，II，与产物单链 DNA 结合 F. 螺旋酶 III，催化双链 DNA 分离，与 SSDNA 结合蛋白质配合。 DNA 旋转酶（Eco 拓扑异构酶 II）
36、多数天然 DNA 具有负超螺旋，可变为泡状单链形式，利于蛋白质结合，并可缓解复制叉前移造成的抄缠现象，但当 5%的环行 DNA 双链已经复制时，原有的负超螺旋已被用尽，若复制叉再前移，就产生拓扑学问题，就需要拓扑异构酶来解决。在 Ecoli 中，主要是 DNA旋转酶（Eco 拓扑异构酶 II） ，他能产生负超螺旋并消除复制叉前移产生的正超螺旋。 所以，如果加入几种 DNA 螺旋酶的抑制剂，如香豆霉素，新生霉素，萘啶酮酸等均能抑制细菌 DNA 的复制，P94 图示复制叉前移的拓扑学问题。 DNA 复制的半不连续性 1. 半不连续性复制的发现 2. 引物和引发酶 DNA 复制过程中，复制叉是不对称
37、的。两条新合成的链中，一条是连续合成的，叫前导链 ；另一条是在模板 DNA 指导下，通过一种叫 DNA 引发酶的蛋白质，在特定的间隔区先合成大约 10 个核苷酸组成的 RNA 引物（RNA primer）为 DNA 聚合酶提供 3-OH，然后合成称为冈崎片段的不连续的 DNA 片段，最后由 DNA 修复系统去除 RNA 引物而代之以 DNA，再由 DNA 连接酶通过 35-磷酸二酯键将其连接起来，完成此子链的合成，这条子链叫后随链。 由于 DNA 聚合酶在没有引物情况下不能从头合成 DNA，必须有一条引物。研究发现的引物大多数为一段 RNA，长度和序列随基因组的种类而异，为 1-10 个核苷酸
38、见表 3 P98。 该引物 RNA 与经典的 RNA（mRNA）不同， ，他们合成后不与模板分离，而是以氢键与模板结合。他可能由一种独特的 RNA 聚合酶所合成，这种合成 RNA 引物的酶旧叫引发酶。那么，前导链是如何合成的？三种可能性：1）同后随链一样，由 RNA 引物提供 3-OH； 2）可能模板上的起始点产生缺口，暴露 3-OH 作引物；3）可能由后随链提供 3-OH。 3. 前体片段的连接 真核生物的 DNA 复制 1 真核生物的复制原点，复制元和复制元族 真核生物的 DNA 聚合酶活性比大肠杆菌低得多，复制速度为 500bp-5000bp/分（Ecoli 为105bp/分）如按哺乳动
39、物的 DNA 比细菌大约 50 倍，真核生物 DNA 复制时间就会是大肠杆菌的 1000 倍，即约一个月，而事实上，真核生物 DNA 复制时间一般为几小时，这是因为通过从许多原点同时开始并双向复制而实现的。放射形自显影可见许多的复制泡。每一复制泡有固定的一点（复制原点） ，然后双向伸展，与相邻的复制泡会合。这样一段 DNA 称为复制单元，简称复制元（replicon） 。而几个复制元可组成复制元族，同一族内的复制元基本同步。 真核生物复制原点的 DNA 序列并无固定的模式，但大多包含一个富含 AT 的序列，可能还有一个特异性蛋白质的结合位点。 2 真核生物的 DNA pol 和引发酶 prim
40、ase 与真核生物多起点复制相适应的是，细胞中 DNA 聚合酶的分子数目多，在 Ecoli 中，POLIII只有 10-20 个分子，而哺乳动物细胞中 DNA POL 有 2000-60000 个分子，DNA POL 与 DNA 引发酶结合很紧，是复制体系必需的复合物。 实验表明，在细胞 DNA 合成期（S 期） ，DNA POL 含量剧增。协同的作用，负责线立体 DNA 的复制，含量变化不大，与损伤 DNA修复有关。 引发酶的作用： B. 是与引发酶复合物所必需的 E. 其引物合成方式特别，阵发性合成，F. 可利用 rNTP 和 dNTP 为合成前体。 引物一般为 6-15 个 NT。 1
41、SV40 以及其他真核生物的 DNA 复制过程 SV40 所编码的蛋白质中，只有一个大 T 抗原参与其 DNA 复制，其余复制机制由寄主的蛋白质构成。大 T 抗原四聚体在复制原点有三个结合位点，同时还具有 ATPase 活性和螺旋酶活性。 SV40 的 DNA 复制有可能代表真核生物的 DNA 复制的主要过程：首先由一特异的蛋白质识别复制原点并与之结合。再由螺旋酶促进负超螺旋状的复制原点解链单链DNA 结合蛋白质（SSB ）维持解链区并以动态左右前移在由 POL 和引发酶与原点上的特异蛋白质相互作用，从而引发复制叉的先导链的合成；然后再印发另一先导链的合成随着复制叉的前进，需要拓扑异构酶解除复
42、制叉前进造成的超缠现象。当相邻的两个复制元的相向的两个复制叉结合时就完成了这一段 DNA 的复制，可能并不存在固定的终止序列。而真核生物染色体末端 DNA 的复制却不那么简单。见后。 2 真核生物染色体末端 DNA 的复制 由于 RNA 引物的水解，两个子代分子中各有一个5端缺少一段核苷酸，而没有一个目前已知的 DNA POL 能填补。 腺病毒 DNA 的 5末端共价连接一个 55kD 的蛋白质，即末端蛋白质（Terminal Protein TP）,而正在复制的腺病毒新生的 DNA 5端为 80kD 的蛋白质，为末端蛋白质前体（pTP） ，这一引发方式避免了线性 DNA 在复制结束后的 5末
43、端隐缩问题。真核生物同样面临线性DNA 复制结束时产生的 5末端隐缩问题。这个问题的解决取决于端粒的结构和能够识别和结合端粒的蛋白和酶。四膜虫端粒中有一种端粒酶（ ）能将其端粒结构中单链尾巴5TTGGGG3延长，延长的部分仍是 5TTGGGG3，这一富含 G 的序列总是突出 12-16个 NT。这种酶是一种核糖核蛋白，由 RNA 和蛋白质组成。有人证明该酶中的 RNA 是富含G 序列的模板，对拷贝出富含 G 序列所必需的部分为 5CAAAACCCCAAAA3，此 RNA 可能还有其他作用，这单链尾巴可能弯转成为引物复制 5末端，另一可能是某种端粒蛋白结合末端的单链重复序列，并作为蛋白质引物复制
44、 DNA 地末端。 复制的调控 DNA 复制是受调控的，细胞分裂时间因营养条件变化很大（21-70 分钟/Ecoli） ，而 DNA复制时间为 40 分钟左右，可用成熟前起始加以解释细胞分裂时间为 21 分钟的 DNA 复制。 DNA 复制调控，可能涉及许多专一性的蛋白因子（Ecoli Dna A,SV40 大 T 抗原等）和至少一类 RNA 分子（RNA2，RNA1） 。细胞中蛋白质和 DNA 总量的比例也可能是一重要因素，因为氨基酸饥饿时会抑制蛋白质合成和 DNA 复制起始。 在此说明一下 RNA2 和 RNA1： 大肠杆菌质粒 Col E1 的复制需要一种 RNA 引物，RNA POL
45、从复制原点上游方向 555bp 处 5)依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶 6)T4 噬菌体多核苷酸激酶 TK：磷酸化 7)碱性磷酸酶 :脱磷酸 细菌碱性磷酸酶(B. Alkaline Phosphatase) 小牛肠碱性磷酸酶(Calf intestinal Phosphatase) 2.目的基因的分离方法及其用途 分离方法 基因分离的物理化学方法 鸟枪法 cDNA 文库的建立与基因的分离 直接从特定的 mRNA 中分离基因 基因组文库的建立和基因的分离 从蛋白质入手分离编码此蛋白的基因 基因的化学合成 利用 PCR or RT-PCR 分离基因 用途 研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结
46、构，功能及其调控 与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗 对策 研究生物种系进化与相关同源性 应用某种基因的大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽 改良某些目的基因，以改良品种 建立基因疗法。选用某种正常基因，引入患者体内，治疗某些先天性遗传疾病。 3.基因工程载体一、定义二、载体具备 3 的条件： 三、载体的种类：质粒载体 细菌用的表达载体 载体 粘粒载体 M13 噬菌体载体 真核细胞用载体 人工染色体（YAC，8 BAC，9 PAC，10 MAC） 4.受体细胞和重组基因的导入5.基因重组的方法与策略 6.基因重组体的筛选 5.2 聚合酶链式反应（PCR
47、第一节 PCR 基本原理和影响因素 1983 年美国 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人发明了聚合酶链反应(polymerase chain re action，PCR)，1985 年公开报道，使人们能在试管内以几小时的反应将 DNA 扩增 109 倍。 1987 年 PCR 得到美国的专利权，PCR 技术在生命科学中掀起了一场革命，并形成了巨大的市场，有人预言，本世纪末 PCR 产值可达到 4x108 美元。本章介绍 PCR 的原理、常用的各种 PCR 方法及主要应用范围。 一、基本原理 DNA 在细胞中的复制是个比较复杂的过程。参与复制的基本因素有：DNA 聚合酶、DNA 连接酶
48、、DNA 模板、由引发酶合成的 RNA 引物、核苷酸原料、无机离子、合适的pH、以及解开 DNA 的超螺旋及双螺旋等结构的若干酶与蛋白质因子等。 PCR 是在试管中进行 DNA 复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的 Taq 酶取代 DNA 聚合酶，用合成的 DNA 引物替代 RNA 引物，用加热( 变性)、冷却(退火、保温(延伸)等改变温度的办法使 DNA 得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使 DNA 无限扩增。PCR 的具体过程如下： 将 PCR 反应体系升温至 95左右，双链的 DNA 模板就解开成两条单链，此过程为变性。然后将温度降至引物的 Km 值以下，3端与 5端
49、的引物各自与两条单链 DNA模板的互补区域结合，此过程称为退火。当将反应体系的温度升至 70左右时，耐热的Taq DNA 聚合酶催化四种脱氧核糖核苷酸按照模板 DNA 的核苷酸序列的互补方式依次加至引物的 3端，形成新生的 DNA 链。每一次循环使反应体系中的 DNA 分子数增加约一倍。理论上循环几次，就增加为 2n 倍。当经 30 次循环后，DNA 产量达 230 拷贝，约为 109个拷贝。PCR 扩增过程见图 8-1。由于实际上扩增效率达不到 2 倍，因而应为（1+R）n，R 为扩增效率。 二、参与 PCR 反应体系的因素及其作用参与 PCR 反应的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA 聚合酶、缓冲液、Mg2+ 、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、反应温度与循环次数、P
