1、ECIS细胞动态分析仪,深圳达科为生物公司, 细胞生物学研究新技术平台,Ivar Giaever Winner of the 1973 Noble Prize in Physics,ECIS技术的发明人,Electric Cell-Substrate Impedance Sensing（ECIS）是一种细胞行为学动态研究的技术平台，能够实时、 定量、无损伤、非介入地研究生长细胞形态、位置、数目等变化。,三大特点： 无损伤的细胞动态研究平台（不用染色、标记） 实时定量地进行测量，实时获取数据 实验结果具有高度可重复性，而传统方法对细胞动态行为多数只能采用定性研究,ECIS 技术简介,ECIS 测
2、量技术原理,ECIS （Electric Cell-substrate Impedance Sensing） 从基底电极板到培养液的电流通过细胞层 细胞数目、形态变化、细胞间、细胞与基底之间连接紧密度、细胞迁移运动等，均导致可测量的电阻值变化,细胞层电阻研究技术 ECIS,基本原理：测量电极与溶液间的电阻当电极上覆盖生长细胞时，由于这些细胞的覆盖率、细胞间连接的紧密程度、细胞与基质间的空间大小等因素影响，会出现电阻变化,上图是直径250um金属圆孔电极的显微照片。金属表面是经过特殊工艺处理过的，适宜细胞生长的区域中心圆孔电极周围的黄色区域是绝缘层，绝缘层同样很适合细胞的生长, 其表面是按正常细
3、胞培养板表面制作的,目前已发表过的相关文献的细胞种类有：BAEC、BPAEC、Caco2-BBE、ECV304、HEK、LP3、MCF-7、MDCK、Myoblast、NRk、Orbital Fibroblasts 、 ROS17/2.8 V79、WI38等数百种细胞系,细胞类型,细胞损伤和修复细胞生长和粘附细胞对药物、刺激物和病毒感染的反应肿瘤细胞浸润和转移细胞微运动细胞趋化流动状态下的细胞行为不同氧环境下细胞生长的研究,ECIS技术的应用领域,ECIS在损伤修复实验中的应用,传统的损伤修复实验： 划痕实验 人为因素的影响 实验结果难于评估,ECIS损伤修复实验：操作自动化实验的高度重复性实
4、时定量地监测细胞损伤修复过程，数据便于统计分析,Electrical Wound-healing For Cells in vitro Charles R. Keese, etc. Nov 24, 2003 PNAS,X轴：时间 Y轴：细胞电阻,上图：BS-C-1细胞按1.25 X 105/cm2加入六孔电极板，细胞逐渐生长至覆盖全板,下图：三个孔的细胞损伤修复实验：第一个孔未作电击 第二个孔以3V 40KHz 10秒电击 第三个孔以3V 40KHz 30秒电击然后观察细胞电击损伤后逐渐修复生长的情况,PNAS. 101: 1554-1559 (2003).,用相差显微镜观察MDCK细胞ECI
5、S损伤修复实验的变化： a) 电击前 e) 电击前活细胞染色（红色代表死细胞） b) 电击后即刻观察 f) 电击后即刻活细胞染色 c-d) 电击后10和20小时观察，见到细胞呈向心性生长修复,类似实验： 六孔电极板 NRK细胞 一个孔未作电击 另五个孔以2.5V 40KHz 分别10、30、60、120、180秒电击 上图：测量细胞层电阻 下图：测量细胞层电容,图中可看到在用高电压对细胞进行损伤后，电阻值瞬间下降，然后再恢复低电压来进行监控其生长修复过程,PNAS. 101: 1554-1559 (2004).,Activation of epithelial CD98 glycoprotei
6、n perpetuates colonic inflammationTorsten Kucharzik1,etc. Laboratory Investigation (2005) 110,Caco2-BBE细胞，电击4.5V，40KHz，30s a. 红线：电极板预包被anti-CD98绿线：电极板预包被对照蛋白 b. a图的显微镜观察图 c. Caco2-BBE细胞用DSS预处理重复a图实验 可见anti-CD98抑制DSS处理的Caco2-BBE细胞损伤修复 d. c图的显微镜观察图,ECIS技术测量细胞生长,比较BSC-1细胞和NRK细胞不同的生长曲线,软骨细胞生长的连续监控,ECIS在
7、细胞、基底膜相互作用方面的研究-细胞外基质和细胞粘附生长的关系,WI-38细胞在不同基质上的生长情况： 四孔电极板分别包被:层粘连蛋白(Laminin)血清(Serum)弹性蛋白(Elastin)纤粘连蛋白(Fibronectin),上图：不同基质对细胞生长促进作用不同,新方法研究细胞在不同基质表面粘附生长的快慢程度,product review Nature . 366 : 591-592(1993).,新方法研究细胞在不同基质表面粘附伸展的快慢程度,一篇文献的分析,Electric CellSubstrate Impedance Sensing (ECIS) as a Noninvasiv
8、e Means to Monitor the Kinetics of Cell Spreading to Artificial Surfaces Joachim Wegener, etc. Experimental Cell Research 259 (2000),MDCK细胞在10-100,000Hz电场下， 0-20小时三维实时生长曲线， 电极板上预铺血清：上图：细胞层电阻 下图：细胞层电容,一篇文献的分析,（1）/（2）： WI-38 / VA-13细胞加入1mM RGDS四肽（箭头处） 对照：加入无关四肽,RGDS,无关四肽,RGDS：Integrin家族核心活性保守四肽序列介导细胞与
9、多种基底膜蛋白相互作用,Measurements of endothelial cell-to-cell and cell-to-substrate gaps and micromechanical properties of endothelial cells during monocyte adhesionNoriyuki Kataoka, etc. 99(24) 2002 PNAS,ECIS同时测量HUVEC细胞： 1 细胞层总电阻 2 细胞与细胞间连接的电阻 3 细胞层与基底膜间的电阻,细胞层总电阻,细胞间电阻,细胞与基底膜间电阻,说明：ECIS仪器具备独特的功能，能单独测量细胞层与基
10、底膜间的电导，通过公式将电导换算成电阻，就得到了细胞层与基底膜间的单独电阻,HUVEC细胞加入单核细胞和不加入单核细胞两种条件下测量HUVEC细胞层的韧性。比较两者可知，加入单核细胞后，HUVEC细胞层变“软”了,GFP标记的单核细胞和红色荧光染色的HUVEC细胞在电极板上混杂生长的荧光共聚焦显微镜三维计算机模拟成像,细胞对药物，刺激物，病毒感染的反应,细胞浸润迁移的研究,ECIS新方法先在电极板上铺内皮细胞形成单层，然后再加入迁移细胞，研究其侵袭转移以及对内皮层细胞的破坏能力，比起传统方法更能真实的模拟内皮层的活性状态，并且有连续性精确性，操作简单，不须人工染色计数等过程，减少了误差,ECI
11、S技术研究细胞侵润,利用ECIS技术测量细胞层电阻变化，比较：AT3细胞（强侵润性）、G细胞（弱侵润性）、和对照（不添加细胞） 对HUVEC内皮细胞的侵润,白细胞侵润,The Lectin-Like Domain of Complement Receptor 3 Protects Endothelial Barrier Function from Activated Neutrophils1. Vassiliki L. Tsikitis, The Journal of Immunology, 2004, 173,10血清（上图） 1血清（下图） MLL细胞对HUVEC细胞层的侵润,Real-T
12、ime Impedance Assay to Follow the Invasive Activities of Metastatic Cells in Culture. Charles R. Keese,etc. BioTechniques 33:842-850 (October 2002),ECIS技术研究细胞趋化,Automated Real-Time Measurement of Chemotactic Cell MotilityNacima Hadjout,etc BioTechniques 31:1130-1138 (November 2001),A：以叶酸为趋化化合物，少量NC4
13、A2细胞从电极板一侧（左下）迁移（右上）测量到的细胞层电阻值变化。由图可见，随着细胞进入电极孔范围，电阻值上升，随着细胞进一步迁移出电极孔，电阻值又下降 B：显微镜下观察迁移过程，与电阻测定值对应,ECIS技术研究细胞迁移,NC4A2细胞在不同叶酸浓度下的趋化速度，以及相应细胞层电阻变化曲线,流动状态下的细胞行为,可模拟匀速流动以及模拟脉博频率的流动,专为流动状态设计的ECIS电极板,不同氧环境下细胞生长的研究,细胞动态分析仪 ECIS Z,ECIS Z的性能参数,Simple impedance Z Constant current Well capacity: 16 or 96 wells
14、 Maximum data acquisition rate (single frequency): 5 point / sec Available frequencies: continuously variable from 4 kHz to 64 kHz Multi-frequency measurements: 8 frequencies ranging from 4 kHz to 64 kHz (10 seconds per well acquisition rate) Measurement range: 500-500 kohms Reproducibility: 1% Woun
15、ding/Electroporation current: 8 step control Percent error in measurement: 2% 10 ohms Sine wave purity: better than 1% harmonic distortion Frequency accuracy: within 1%,细胞动态分析仪 ECIS Ztheta,ECIS 96孔电极数据采集及软件分析界面,ECIS Ztheta的性能参数,Complex impedance Z, R and C Constant current Well capacity: 16 or 96 we
16、lls Ability to model multi-frequency data (barrier function) Maximum data acquisition rate (single frequency): 5 point / sec Available frequencies: continuously variable from 50 to 100 kHz Multi-frequency measurements: 11 frequencies ranging from 62.5 Hz to 64 kHz (10 seconds per well acquisition ra
17、te) Measurement range: 100-500 kohms, 0.2 -100 nFarads Reproducibility: 1% Wounding/Electroporation current: 256 step control Percent error in measurement: 1% Sine wave purity: 0.25% harmonic distortion Frequency accuracy: within 0.002%,部分研究领域,1、表皮损伤的创面修复及相关的药物研发、测试 2、肿瘤转移/侵袭的基础研究及相关的药物研发 3、心血管研究中关于
18、血管内皮的研究 4、炎症反应中关于水肿 5、肿瘤血管/淋疤管新生研究及抑制其新生药物研究 6、肺内皮研究，内皮通透性 7、药物与血脑屏障、胎盘屏障的研究等,新药开发： 药物毒理学分析学 抗肿瘤药物筛选和研制 抗肿瘤药物治疗效果观察 抗肿瘤转移药物筛选和研究 神经营养药物的筛选和研究 现代中药的开发和药理机理分析 基础生命科学： 基因功能学研究 细胞表面受体配体结合研究 细胞生长、分化的微环境研究 细胞生长调节因子的生物学功能研究 细胞生长、分裂和死亡的分子基础研究,应用前景,ECIS发表文献不完全统计 （2005）,发表文献水平统计,发表文献年代统计,诺和诺德制药公司,哈佛大学医学院,美国CDC-NIOSH中心,加州大学洛山基分校,加拿大国家研究中心,约翰.霍普金斯大学,俄亥俄州立大学,Allergan公司,Genentech公司,ECIS部分用户（目前全球超过350个研究平台）,布朗大学,谢 谢,
