1、实验一 显微镜油镜的使用,目的要求显微镜油镜使用的原理实验材料实验程序实验报告,目 的 要 求,学习并掌握显微镜油镜的使用技术学习并掌握显微镜油镜维护,显微镜的构造 1.光学部分:接目镜 、 接物镜 、 照明装置(聚光镜、 虹彩光圈、 反光镜等). 它使检视物放大,造成物象. 2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件.它起着支持 调节 固定等作用.,显微镜油镜使用的原理,双筒光学显微镜,显微镜油镜使用的原理,显微镜的放大倍数和分辨率 1.放大倍数=接物镜放大倍数接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力
2、，可用公式表示为： D=/2nsin(/2 ) 式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折射率。 ：镜口角（即入射角）。,显微镜油镜使用的原理,油镜使用的原理1. 香柏油的折射率与玻璃接近，提高了视野的照明度。2 . 提高了显微镜的分辨率,实 验 材 料,显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。 细菌三型、霍乱弧菌等固定装片,实验程序（显微镜的使用）,主要是油镜的使用 1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 2.调节光亮度 3.低倍镜观察：粗调、细调 4.依次再进行中倍、高倍观察 5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升
3、聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。 7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。,实验程序（显微镜的使用）,显微镜保养和使用中的注意事项： 1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.观察时，两眼睁开，养成两眼能
4、够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。 5.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。,实验报告,油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？使用油镜时，为什么必须用香柏油？镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？,再见,目的要求 实验材料,实验程序,实验报告,实验二 细菌基本形态和特殊结构的观察,1.用油镜结合细菌三型等染色片，观察细 菌基本形态（球形、杆形和螺旋形），边观察边绘图。 2. 辨认细菌的特殊构造变形杆菌的周鞭毛铜绿假单胞菌绿脓杆菌
5、丛鞭毛破伤风芽胞梭菌芽孢肺炎球菌荚膜,目 的 要 求,实 验 材 料,显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。细菌三型：葡萄球菌、大肠杆菌、霍乱弧菌等示教片。 细菌特殊结构：变形杆菌、绿脓杆菌、破伤风梭菌等细菌的特殊结构示教片。,金黄色葡萄球菌,基本形态的观察,基本形态的观察,溶血性链球菌,基本形态的观察,大肠杆菌,基本形态的观察,霍乱弧菌,特殊结构的观察,变形杆菌,鞭毛,特殊构造的观察,肺炎球菌（荚膜染色）,荚膜,特殊构造的观察,破伤风梭菌,枯草芽孢杆菌,芽孢,实验报告,镜下绘出细菌三型 镜下绘出所见细菌的特殊结构,再见,实验三 细菌的革兰氏染色,目的要求革兰氏染色原理实验材料实验程序实验
6、报告,目 的 要 求,1.初步掌握细菌涂片方法 2.掌握革兰氏染色法步骤,革兰氏染色的基本原理,根据细菌细胞壁的组分和结构不同，通过革兰氏染色法可将所有的细菌区分为两大类G+和G-,革兰氏染色是丹麦医生 C.Gram（革兰）于1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。,实 验 材 料,金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)斜面培养物 大肠杆菌(E.coli)培养物 革兰氏染色液 显微镜,细菌涂片制备过程,革兰氏染色的过程 制片,革兰氏染色的过程 染色,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,革兰氏染色注意载玻片要洁净，滴无菌水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不宜过厚；热固定温度不宜过
7、高，（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态；水洗时不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，过大，以免涂片薄层脱落。 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌。 美蓝染色注意染液不宜过多或过少，否则在盖上盖玻片的时,菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察；同样，盖玻片的不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。 霉菌直接制片注意挑菌和制片时要小心，尽可能保持霉菌的自然生长状态，加盖玻片时勿压入气泡，以免影响观察。,注意事项,实验报告,1绘图说明经革兰氏染色后大肠肝菌和金黄色葡萄球菌的染色结果
8、。,实验报告,思考题： 你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色出现什么问题？ 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色?你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？,再见,实验四 细菌分离培养,实验材料 实验程序 目的要求 实验报告,目的要求,了解培养基制备过程及常用培养基的种类 学会细菌的接种方法及无菌操作法 学会微生物的分布情况，建立无菌观念 了解常用消毒灭菌方法并
9、验证其杀菌作用 了解药敏试验的操作方法,实验用品,小试管 高压灭菌器培养皿 营养吸管 半固体三角玻扒 蛋白胨水烧杯 天平量筒 玻璃吸管玻棒 标签贴纸 药匙 铁丝剪刀 电炉,实验程序,（一）培养基的配制同学们先将试管贴好标签。注明培养基名称，组别，日期。标签粘贴位置在离管口1/3管身处。注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。 操作图示：,培养基配方：,牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 蒸馏水 固体培养基：加2-3%的琼脂 半固体培养基：0.2-0.3%琼脂,配制肉汤斜面培养基50 mL将小烧杯置天平上，用药匙取营养肉汤干燥培养基，称取1 g先加少量蒸馏水，溶解彻底再转移到量筒，定容至50ml，
10、然后倒在250 mL烧杯里，加入琼脂1g（2%），浸泡于液体培养基里，液面位置做好标记，在电炉上加热融化后（注意补充蒸发的水分以保持原体积不变），用分液漏斗分装6支小试管，每支5 mL左右（约试管高度的1/5左右）， 用硅胶塞塞好试管口，再用防潮纸和棉绳将试管塞罩住扎成一捆。,用漏斗分装培养基及摆斜面,培养基灭菌培养基分装好后，塞上棉塞，外面再包一牛皮纸，便可灭菌。灭菌的时间和温度按各培养基规定进行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。培养基经灭菌后，可放在37恒温箱培养24小时，无菌者方可使用。在实验室里用得最多的加热灭菌法是高压蒸汽灭菌和干热灭菌。一般培养基和灭菌水等用高压蒸汽灭菌，而
11、玻璃器皿常用干热灭菌。蒸汽灭菌为105-121，15-20分钟，干热灭菌为160-170，1-2小时。目的都是使细菌体内蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 在同一温度下，湿热杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固，同时湿热穿透力强，而且当蒸汽与被灭菌物体接触凝成水分时，又可放出热量，使温度迅速增高，从而增加灭菌效力。,高压蒸汽自动灭菌锅,手提式高压蒸汽灭菌锅,包装 1培养皿：以旧报纸密密包紧，一般以6套做一包，待灭菌。 2吸管：在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段1.5cm长的棉花。棉花要塞得松紧恰当（过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会下滑），然后分别将每支吸
12、管尖端斜放在旧报纸条的的近左端，与报纸约呈60角，并将右端多余的报纸打一小结。 3三角玻扒：跟包扎吸管相似，将三角部分斜放在报纸条的近左端，与报纸约呈45角，并将右端多余的报纸打一小结。,1.灭菌器内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。2.接通电源，进行加热。 3. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。 4.当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时，此时灭菌器内的温度为1210C，维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力
13、，延长时间。 5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。,灭菌,放置斜面,（二）微生物接种 原理：接种技术是微生物学实验及研究中的一项最基本的操作技术。接种是将纯种微生物在无菌操作条件下移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要的培养基中。为了获得微生物的纯种培养（指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代），要求接种过程中必须严格进行无菌操作，一般是在无菌室内，超净工作台火焰旁或实验室火焰旁进行。 根据不同的实验目的及培养方式可以采用不同的接种工具和接种方法。常用的工具有接种环、接种针、接种铲、玻璃涂棒，移液管及滴管等
14、。常用的方法有斜面接种，液体接种，穿刺接种和平板接种，这些方法在后面的实验一一进行训练。,微生物的斜面接种技术：从已长好微生物的菌种管中挑取少许菌苔接种至空白斜面培养基上的过程。 斜面接种的操作方法： （1）操作前，先用75%酒精擦手，作表面消毒，待酒精挥发后才能点燃 酒精灯。（可通常是点燃酒精灯再用酒精擦手。） （2）用斜面接种时，将菌种管和斜面管握在左手的大拇指和其他四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处在水平位置。 （3）先将菌种管和斜面管的试管塞旋转一下，以便接种时便于拔出。 （4）右手拿接种环，拿的方式与普通日常拿笔一样。将要伸入试管部分的金属柄和金属丝在酒精灯火焰上灼烧灭菌。 （
15、5）用右手小指、无名指或手掌将菌种管和斜面管的试管塞同时拔出，并把塞子握住，不得任意放在桌上或与其他物品接触，再以火焰烧管口。,（6）将上述在火焰上灭菌过的接种环伸入菌种管内，使接种环在接种菌种前先在试管内壁上或空白培养基接触一下，使接种环充分冷却，以免烫死菌种然后用接种环在菌落上轻轻地接触，刮取少许后将接种环自菌种管内抽出。抽出时勿与管壁相碰，也勿使再通过火焰。 （7）迅速将沾有菌种的接种环伸入斜面培管中，在斜面上，自下而上划线，使菌种沾附在培养基上，划线时勿用力，否则会使培养基表面划破。 （8）接种完毕后将接种环抽出，灼烧管口，塞上试管塞。塞试管塞时勿要用试管口去迎试管塞，以免试管在移动时
16、侵入杂菌。 （9）接种环在放回原位前，要经火焰灼烧灭菌。同时须将试管塞进一步塞紧以免脱落。,接种菌名及接种划线方式、接种工具： 细菌：枯草杆菌，大肠杆菌，单球菌，谷氨酸菌，假单孢杆菌，巨大芽孢杆菌（6支）（接种方式：“之”字划线，接种工具：接种环）霉菌：黑曲霉，黄曲霉，根霉（3支）（接种方式：点植或划直线，接种工具：接种钩或接种环）酵母菌：面包酵母菌，古巴酵母菌，假丝酵母菌（3支）（接种方式：划直线，接种工具：接种环）,图4 11 各种无菌操作接种技术示意图,图4 11 各种无菌操作接种技术示意图,各种无菌操作接种技术示意图,将接种好的斜面试管置最适合该菌种生 长的恒温培养箱里。一般细菌于37
17、恒温培养箱培养1-2d 一般霉菌和酵母菌于32恒温培养箱培养2-3d,生物的培养技术培养箱恒温培养法,穿刺接种操作过程示意图,（三）环境条件对微生物的影响,温度对微生物的影响 紫外线对微生物的影响 化学药剂对微生物的影响 抗生素对微生物的影响,温度对微生物的影响,在微生物的生长范围内有最高、最适、最低生长温度，一旦超过最低和最高生长温度，微生物均不能生长，或处于休眠状态，甚至死亡。 每组取牛肉膏蛋白胨细菌斜面培养基6支，在无菌操作下，用枯草杆菌斜面菌种进行斜面接种。各取2支标记280C、600C、40C(冰箱）分别放入相应温度下培养，48h后观察记录并做实验报告。,紫外线对微生物的影响,紫外线
18、对微生物有明显的致死作用，波长260nm紫外线具有最高的杀菌效应。剂量高、时间长、距离短时就易杀死它们。 光复活现象：经紫外线照射后受损害的细胞，如立即暴露在可见光下，则有一部分仍可恢复正常活力。 实验方法：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基按无菌操作制成平板1付，用无菌移液管吸取0.1mL灵杆菌菌液涂布于平板上（用无菌三角玻棒）。在无菌室中，将无菌五角星黑纸放置于平板，在距离紫外灯的30cm处照射20min，去黑纸加皿盖（如图）。于28300C温箱中倒置培养48h后记录结果,紫外线对微生物的影响,化学药剂对微生物的影响,一些化学药剂对微生物生长有抑制或杀死作用，因此在实验室中及生产上常利用某些化学药剂
19、进行灭菌或消毒。 1. 每组取无菌培养皿两付，在皿底注明处理方法及菌种名称。 2.取枯草杆菌和金黄色葡萄球菌0.2mL放入相应的培养皿中. 将已熔化冷却至500C左右的细菌培养基分别倒入上述培养皿中，混匀后凝固成平板。 用镊子将分别滴有两滴0.1%HgCl2，2.5%碘酒，75%酒精，5%石炭酸的小圆形滤纸片，放于每一平板上，盖上皿盖，于28300C的温箱中培养48h后记录结果。 如果有抑制作用，则滤纸片四周出现无菌生长的抑菌圈，圈的大小可表示消毒剂抑菌的强弱（见图-2）。,化学药剂对微生物的影响,抗生素对微生物的影响,抗生素的定义:某些微生物，特别是放线菌，在生命活动过程中产生了一些对其本身
20、无害而能抑制或杀死另外一些微生物的特异性的代谢产物，这些特异性的代谢产物称为抗生素。产生抗生素的微生物称为抗生菌。 抗生素在极低浓度下即能抑制或杀死某些微生物。在抗生菌的筛选中，常以其对某些微生物产生的拮抗作用所形成的抑菌圈大小来衡量抗生菌作用的强弱和抗生素的有效浓度,抗生素对微生物的影响,试验方法： 1.将枯草杆菌斜面和黑曲霉斜面各用4mL无菌水，以无菌操作法制成菌悬液备用。 2.取两付无菌平皿，皿底贴上标签，注明组别及处理，各自用无菌吸管取上述菌悬液各1mL，分别加入相应底培养皿内。 3.取已融化并保持在500C左右的细菌和真菌培养基各1管，倒入相应的培养皿中，轻轻摇匀，制成含菌平板。 4
21、.用无菌打孔器在长有“5406”放线菌的培养皿中，无菌操作垂直钻取连有培养基的菌块。用灭菌镊子将“5406”菌块移至平板上，每个平板放四块。 5.培养皿正放在28300C温箱中培养23d观察菌块周围的透明圈（抑菌圈）大小。并写实验报告。,四、实验报告,接种环(针)接种前后灼烧的目的是什么? 为什么在接种前一定要将其冷却？ 如何判断灼烧过的接种环已冷却?,四、实验报告,培养基应具备哪些条件?,四、实验报告,高压蒸汽灭菌的关键为什么是 高温而不是高压? 高压蒸汽灭菌前为 什么要将灭菌锅内的冷空气排尽? 灭菌完毕后什么情况下才 可以开锅盖取出灭菌物品？,四、实验报告,药敏实验的原理， 结果如何？,再
22、见,实 验 九 抗 酸 染 色 目的要求实验程序实验材料实验报告,一、实验目的 1、了解结核杆菌形态、生长及培养特点 2、掌握抗酸染色的原理和方法 3、学会抗酸染色报告单的填写,二、实验重点,1、抗酸染色的原理及方法2、抗酸染色报告单的填写,三、实验难点,抗酸染色的方法,形态：结核杆菌细长略弯曲，端极钝园，大小约140.4um ，呈单个或分枝状排列，无荚膜、无鞭毛、无芽胞。在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等。,结核杆菌的培养特点,培养基：罗-琴氏（Lowenatein Jensen）培养基主要成分：蛋黄；甘油；天门冬素；马铃薯淀粉；无机盐；孔雀绿；蛋黄含
23、脂质生长因子，能刺激生长，孔雀绿可抑制杂菌生长。,生长特点：缓慢；2-4周可见菌落；呈乳白色或米黄色，不透明，粗糙型颗粒状，结节状，菜花状菌落。 液体培养基中呈膜样生长。,分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。 齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为兰色。,四、实验原理,五、实验材料 细菌：结核杆菌
24、染液：石炭酸复红液、3%盐酸酒精碱性美兰溶液 其它：接种环、酒精灯、载玻片等,六、实验方法1、细菌涂片标本的制备涂片 干燥 固定,六、实验方法 2、染 色,3、油镜观察,初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红 2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少， 应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。 脱色：3%盐酸酒精脱色30秒1分钟；用水冲洗。 复染：用碱性美兰溶液复染1分钟，用水冲洗后用 吸水纸吸干。,七、注意事项,1.无菌操作 2.涂片厚度要适中 3.固定 4.冲洗 5.染色时间 6.初染加热的温度，勿沸腾,八、实验结果,结核杆菌呈红色
25、，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。 背景及非抗酸性细菌呈兰色。,抗酸染色镜下图：,标准报告所得结果：, 1)抗酸杆菌阴性： 连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。 2)抗酸杆菌可疑()：12条抗酸杆菌/300视野。 3)抗酸杆菌阳性(1+)：39条抗酸杆菌/100视野。 4)抗酸杆菌阳性(2+)：19条抗酸杆菌/10视野。 5)抗酸杆菌阳性(3+)：19条抗酸杆菌/每个视野。 6)抗酸杆菌阳性(4+)：10条抗酸杆菌/每视野 镜检结果，应及时记录在化验报告单上。痰涂片化验单应包括痰标本的性状。阴性结果应填记“阴性“不得以“(-)“表达。300个视野内仅见12条 抗酸杆菌者，应在报告单上注明条数，医生可结合胸片进行判断。必要时再取标本复查证实 ，仍见12条抗酸杆菌/300个视野，该病例可确诊为涂阳病人。标本应在送检48小时内报告结果。,九、实验报告,1、写出抗酸染色的原理、方法并绘出 镜下示意图2、填写抗酸染色报告单,十、实验安排,分两个实验室进行，4名同学一个小组每个小组一套实验器材,十一、实验小结,1、总结本次实验的结果并分析其原因2、清理污染物并整理实验台,结束,
