1、实验二 高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因一、目的要求1、学习高效液相色谱仪的操作。2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。二、基本原理咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名称为 1,3,7-三甲基黄嘌呤。咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因约为 1.21.8%，茶叶中约含 2.04.7%。可乐饮料、APC 药片等中均含咖啡因。其分子式为 C8H10O2N4，结构式为：NNCH3H3C OONNCH3定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因
2、与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间 tR 和峰面积 A 后，可直接用 tR 定性，用峰面积 A 作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。三、仪器和试剂1、Agilent 1100 高效液相色谱仪。2、色谱柱：Kromasil C18，5 1504.6mm。3、流动相：30% 甲醇（色谱纯）+70%高纯水；流动相进入色谱系统前，用超声波发生器脱气 10min。4、 咖啡因标准贮备溶液：将咖啡因在 110下烘干 1h。准确称取 0.
3、1000g咖啡因，用二次蒸馏水溶解，定量转移至 100mL 容量瓶中，并稀释至刻度。标样浓度 1000gmL-1。5、测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。6、 20L 平头微量注射器。四、实验内容1、 标准贮备液配制质量浓度分别为 20、40、60、80gmL -1 的标准系列溶液。 （1mL ，2mL，3mL、4mL 稀释为 50mL）2、 谱仪器条件：泵的流速：1.0mL/min；检测波长：275nm；进样量：10L；柱温：室温。3、 仪器基线稳定后，进咖啡因标准样，浓度由低到高。4、 品处理如下：（1）将约 25mL 可口可乐置于一 100mL 洁净、干燥的烧杯中，剧烈搅拌 30min 或
4、用超声波脱气 5min，以赶尽可乐中二氧化碳。 （2）准确称取 0.04g 速溶咖啡，用 90蒸馏水溶解，冷却后待用。 （3）准确称取0.04g 茶叶，用 20mL 蒸馏水煮沸 10min，冷却后，将上层清液，并按此步骤再重复一次。将上述三种样品分别转移至 50mL 容量瓶中，并定容至刻度。5、 上述三份样品溶液分别进行干过滤（即用干漏斗、干滤纸过滤） ，弃去前过滤液，取后面的过滤液，备用。6、 别取 5mL 可乐、咖啡饮料和茶叶水用 0.45m 的过滤膜过滤后，注入2mL 样品瓶中备用。7、 “Agilent 1100 高效液相色谱仪操作规程”分析饮料试液。五、结果处理1. 测定每一个标准样
5、的保留时间（进样标记至色谱峰顶尖的时间） 。2. 确定未知样中咖啡因的出峰时间。3. 求取样品中咖啡因的浓度。记得实验结果如下：序号 标 样 浓 度 gmL-1 保留时间 tR 色谱峰面积 S 色谱峰高度 H1 20 5.037 706020 416742 40 5.037 1297842 711673 60 5.086 1737510 962724 80 5.071 2073782 1106235 茶叶 5.120 1646966 94330y = 22715x + 318050 R2 = 0.9843050000010000001500000200000025000000 20 40 60
6、 80 100标 样 浓 度 gmL-1色 谱 峰 面 积 S将标样的数据利用 EXCEL 软件绘图，并计算回归方程，如下：将茶叶、百事可乐、速溶咖啡测试所得的峰面积代入回归方程计算浓度：六、注意事项1、不同的可乐、茶叶、咖啡中咖啡因含量不大相同，称取的样品量可酌量增减。2、若样品和标准溶液需保存，应置于冰箱中。3、为获得良好结果，标准和样品的进样量要严格保持一致。七、思考题1、用标准曲线法定量的优缺点是什么？答：标准曲线法的优点是：绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析。标准曲线法的缺点是：每次样品分析的色谱条件（检测器的响应
7、性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准6 百事可乐 5.098 2148124 1179647 速溶咖啡 5.185 431571 25125标 样 色谱峰面积 S 浓度 gmL-1茶叶 1646966 58.5039百事可乐 2148124 80.56676速溶咖啡 431571 4.997623确含量的样品） ，而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。2、根据结构式，咖啡因能用离子交换色谱法分析吗？为什么？答：不行。因为离子交换色谱以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有
8、固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。平衡常数 K 值越大，表示组分的离子与离子交换树脂的相互作用越强。由于不同的物质在溶剂中离解后，对离子交换中心具有不同的亲合力，因此具有不同的平衡常数。亲合力大的，在柱中的停留时间长，具有高的保留值。依据咖啡因的结构式 1,3,7-三甲基黄嘌呤或 3,7-二氢-1,3,7 三甲基-1H- 嘌呤-2,6-二酮，其解离常数很小，不符合离子交换色谱的要求。4、在样品干过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结果？为什么？答：干过滤主要是保持溶液浓度不变而采取的一种过滤方法，前液中可能有一些滤纸或滤膜上的杂质存在，为了保持溶液浓度不变，所以要将前液去掉。干过滤为分离掉溶液中的固体,并且不改变溶液浓度而采取的一种方法。为保持溶液浓度不变。前段滤液要弃去，并且滤纸漏斗盛接的烧杯都要干的。这样做不会影响实验结果。
