1、实验一 柠檬酸发酵1、实验目的 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及中间分析方法。2、实验原理黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径(EMP) 和 HMP途径转变为丙酮酸;丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和 CO2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶 A，然后在柠檬酸合成酶（柠檬酸缩合酶） 的作用下生成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的 a-酮戊二酸脱氢酶受阻遏， TCA 循环变成“马蹄形” ，代谢流汇集于柠檬酸处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。
2、其理论反应式为C6H12O6+1.5O2C 6H8O7+2H2O 柠檬酸理论得率为 106.7%;若以含一个结晶水的柠檬酸计为 116.7%。3、实验装置与流程(I)实验装置与材料:A、实验装置：旋转式摇床、恒温培养箱、高速离心机 (4000-6500r/min) 。B、菌种 :黑曲霉柠檬酸生产菌株 Co8-27。C、材料 ：麸皮，马铃薯,薯干淀粉,蔗糖,玉米粉,大麦芽，大米,琼脂,淀粉酶(中温酶与高温酶)。D、器皿：15mL 试管，100mL 三角瓶，2000mL 烧杯 ,500mL 三角瓶,离心管若干。E、试剂:0.1429mol/LNaOH，1% 酚酞试剂，费林甲，乙溶液， 0.01%标
3、准葡萄糖溶液。(II)实验流程:保藏菌株活化菌株(斜面培养)200mL 三角瓶麸曲培养5001000mL 三角瓶液体发酵。(III)斜面培养基 :马铃薯琼脂培养基：去皮马铃薯 200g 切成小块,加水约 500mL,煮沸 30min，然后用纱布过滤,滤液加蔗糖 20g，琼脂 20g，溶化后自来水定容至 1000mL，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内，121C 灭菌 20min，取出摆成斜面备用。摇瓶发酵培养基：取细度为 40 目以上的淀粉 68g，装入 500mL 三角瓶中,再加入物 40mL 水和 5 个单位淀粉酶(中温)/g 淀粉,于 75-80C 下液化 15min。瓶口塞入 8 层纱布
4、包扎好,于 1l0C 灭菌 1520min,冷却备用。取细度为 60 目以上的玉米粉 300g 装入 2000mL 烧杯中,加入 1000mL 水和 7-8 个单位 a-淀粉酶(高温)/g玉米粉,80C 液化 10min 后,继续加热至 90C 保温 30min,碘检不变色后，再加热到 100煮沸(510min),趁热经过二层纱布过滤 ,加水冷却并调整糖度至 15%20%和蛋白质含量不超过 4g/L，取过滤液 40mL 分别装入 500mL 三角瓶中,瓶口塞入8 层纱布包扎好，于 121C 灭菌 15-20min 冷却备用。4、实验步骤及方法(1)种子制备:(A)斜面种子制备 :用接种环挑取冰
5、箱保存的斜面菌种于斜面培养基上, 于 35C 恒温箱中培养35d,待长满大量 孢子后,即内活化的斜面种子。(B)孢子悬浮液的制备: 用无菌移液管吸取 5mL 无菌水至黑曲霉斜面上,用接种环轻轻刮下孢子,装入含有玻璃球的三角瓶,盖好塞子振荡数分钟。每支斜面的孢子悬浮液可接 23 瓶麸曲三角瓶。(2)摇瓶发酵培养:将麸曲孢子(或直接将斜面种子)于上述薯干粉或玉米粉的摇瓶发酵培养基中。接种量：一支斜面接 45 瓶,一瓶麸曲孢子接 20-35 瓶。500mL 三角瓶装液40mL,于转速为 200r/min(24h 前为 100r/min,24h 后为 200r/min)、300r/min(24h 前为
6、 100r/min,24h 后为 300r/min)旋转摇床上,35 0C 下培养 3-4d。(3)发酵过程检测:（A) 发酵 0、24、48、72、96h 分别各取下两瓶检测残糖、柠檬酸含量,以观察发酵过程中黑曲霉的耗糖与柠檬酸生成速率。反应条件:24h 前为 100r/min,24h 后为 200r/min。（B）柠檬酸含量检测:一般检测发酵过程中的总酸,采用 0.1429mol/LNaOH 溶液滴定发酵过滤清液。（C）总 糖及残糖(还原糖)测定:采用费林试剂法。5、实验结果与记录表5 黑曲霉柠檬酸摇瓶液体发酵发酵时间/h 残糖/% 柠檬酸(总酸)含量/% 糖酸转化率/%0 瓶 1瓶 22
7、4 瓶 1瓶 248 瓶 1瓶 272 瓶 1瓶 2反应条件:24h 前为 100/min,24h 后为 300r/min6、实验数据处理(1)平均耗糖速率(g/h): 单位时间内黑曲霉消 耗糖(还糖)的克数。(2)平均柠檬酸 生成速率(g/h):单位时间内黑曲霉生成 柠檬酸的克数。(3)糖酸转化率(%): 黑曲霉生成拧橡酸的克数与消耗(还原糖)的克数之比的百分数。7、思考题(1)试以发酵时间为横坐标,以糖消耗量、柠檬酸生成糖酸转化率为纵坐标作图,说明三者随发酵时间的变化,并加以分析。实验二、抗生素发酵实验1、实验目的通过添加抑制剂的方法,加深对抗生素代谢调控发酵的理解,掌握抗生素研究中常用的
8、比色、纸层析等实验技术。2、实验原理四环素族抗菌素包括金霉素、四环素和土霉素。它们的化学结构极为相似。R1 R2金霉素 Cl H土霉素 H OH四环素 H H因为金霉素比四环素只多一个氯离子,所以只要在发酵加入能够阻止氯离子进入四环素分子的物质,从而使菌种产 多的四环素。本实验中,利用溴离子在生物合成过程中对氯离子有竞争性抑制作用的原理,通过加入硫醇苯噻唑(即 M-促进 剂) 抑制氯化酶的作用,增加四环素的产量。实验利用比色法测定四环素和金霉素的效价。四环素和金霉素在酸性条件下,加热，可产生黄色的脱水金霉素和脱水四环素,其色度与含量成正比。碱性条件下,四环素较稳定,金霉素会生成无色的异金霉素。
9、根据上述原理,可以在酸性条件下,利用比色法测定四环素需求混合液的总效价,而四环素效价的测定可在碱性条件下，使金霉素生成无色的异金霉素,然后再在酸性条件下，使四环素生成黄色的脱水四环素,经比色测得四环素效价。总效价与四环素效价二者之差即为金霉素的效价。发酵液中加入乙二胶四乙酸二钠盐(EDTA) 作为螯合剂,掩饰金属离子的干扰,改变四环素脱水条件(降低酸度或延长加热时间)，可以减少发酵液中所含杂质对比色反应的干扰。3、实验仪器与材料250mL 三角瓶(x12 个),500mL 三角瓶(x 48 个),50mL 容量瓶，1mL、5mL 和10mL 吸管,粗口吸管,新华 1 号滤纸,层析缸，比色计等。
10、孢子培养基(g/ L)：小麦麸皮 35,琼脂 20,合成水MgSO 40.1，KH 2PO40.2,(NH4)2HPO40.3,蒸馏水配制,自然，pH。种子培养基(g/L):黄豆饼粉 20，淀粉 40、酵母粉 5,蛋白胨(NH 4)2SO43,MgSO40.25, KH2PO40.2,CaCO34。发酵培养基(g/L): 黄豆饼粉 40,淀粉100，酵母粉 2.5,蛋白胨 15，(NH 4)2SO43，MgSO 40.25，CaCO 35，a-淀粉酶活力为 105u/mL0.1mL。草酸，EDTA，HCl，NaOH ，pH3.0，柠檬酸缓冲液,正丁醇,氨水。菌种：金色链霉菌（Streptrom
11、yces aureofaciens） 。4、实验步骤及方法(1) 孢子制备:金霉素霉菌接种在杀菌后的孢子斜面培养基 上，37C 培养 5d，当孢子长成灰色时,可用于接种子摇瓶。(2)种子制备: 将种子培养基 25mL 加入到 250mL 摇瓶中，杀菌后接种 1cm2 斜面孢子,于 280C 培养 20h,观察浓度达到要求时可转接发酵摇瓶。(3)发酵:在发酵培养基中分别加入下列成分进行发酵,比较它们对四环素产量的影响,加 0.2%的 NaBr; 加 0.2%的 KCl;加 0.2%的 NaBr 和 0.0025%的 M-促进剂(原始溶液为 50%)；对照( 除发酵培养基外不加其他物质)。于 50
12、0mL 摇瓶中装入发酵培养基 50mL,杀菌后接入 10%种子,在 28C 摇床培养 5d,每隔 12h分别采用纸层析法测定效价。质量法测定菌体量。(4)四环素效价测定:取一定量发酵液 ,加草酸酸化 1.5-2.0 后过滤,取滤液 1mL(效价约为 1000u/mL)于 50mL 容量瓶中,加入 1mL1%的 EDTA 溶液,加水 9mL,再加入 3mol/L 的 NaOH,在 20-250C 保温 15min 后,加入 2.5mL6mol/L 的 HCl,煮沸15min 后,冷却,在分光光度计上于 440nm 处测定其吸光度值。对照样品与上述步骤一样,只是在加入 HCl 后,与不加热,释至刻
13、度。5、实验数据处理发酵培养时,每一种培养基用 500mL 摇瓶培养 12 瓶,分别在 0 时间和间隔12h 取一瓶,除测定四环素效价外，采用质量法测定菌体量,结果如表所示。时间 四环素效价 菌体量 单位菌体产量 菌体生产率/h /（u/mL） /（g/L） /（u/g） /u/（g.h）02448726、结果与讨论(1)四环素类抗生素是由糖和 NH2-衍生而成。四环素的母核是由乙酸或丙二酸单位缩合形成的四联环,氨甲酰基和 N-甲基分别来自 CO2 和甲硫氨酸。根据这一原理,试讨论四环素的生物合成途径。(2)除按上表给出相应数据外,并以时间为横坐标,表中数据为纵坐标绘图,分析各量的变化规律。(3)实验报告中给出完整的实验步骤,讨论各步骤的注意事项与必要性。7、思考题1 种子培养 20h,发酵培养 5d;为使操作方便,尽可能在白天工作，如何确定接种与发酵过程取样时间。2 如何把握接种量？采用什么方法接种？
