1、抗感染纳米羟基磷灰石局部药物缓释微球的研制及体外释药实验 作者：王永峰 1；靳安民 1；魏坤 2；王旭东 2；汤善华1；闵少雄 1 ( 1南方医科大学珠江医院骨科中心，广东 广州 510282； 2华南理工大学材料学院，广东 广州 510641)摘要：目的 研制抗感染纳米羟基磷灰石(nano-HA)药物缓释微球，为骨髓炎的治疗提供一新型的局部药物缓释系统(DDS)。方法 采用 nano-HA 为载药核心载体，外包裹生物相容性好且可降解的聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物/聚乙二醇(PHBV/PEG)，承载硫酸庆大霉素(GM)制成 nano-HA-PHBV/PEG-GM 缓释微球，研究其结构及体外释
2、药特性。结果 微球具有明显缓释作用，90 mg DDS 体外释放实验显示第 1 天释放量为 165.2 g/mL，其后下降并以较低水平稳定释放，维持有效释药时间在 28 d 以上。结论 抗感染 nano-HA 药物缓释微球具有良好的体外缓释作用，有广泛的应用前景。关键词：纳米羟基磷灰石；聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物；聚乙二醇；硫酸庆大霉素；局部药物释放系统中图分类号：R912；TQ467 文献标识码：A 文章编号：1673-4254(2006)06-0754-03Development of an anti-infection nano-hydroxypatite drug delivery
3、 microsphere and its drug-release in vitroWANG Yong-feng1； JIN An-min 1； WEI Kun 2； WANG Xu-dong 2； TANG Shan-hua1； MIN Shao-xiong 11Department of Othopedics, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282, China; 2Institute of Material Science and Engineering, South China Universi
4、ty of Technology, Guangzhou 510641, ChinaAbstract: Objective To develop an anti-infection nano-hydroxypatite (nano-HA) microsphere for local drug delivery for treating osteomyelitis. Methods The nano-HA was used as the core carrier to load gentamicin (GM) and coated with poly(-hydroxybutyrate-co-hyd
5、roxyvalerate)/polyethylene glycol (PHBV/PEG), which was degradable and biocompatible, to prepare nano-HA-PHBV/PEG-GM microsphere. The surface structure and in vitro drug-release of the microsphere were studied. Results The microsphere had good drug delivery capability. The samples weighing 90 mg eac
6、h were soaked in PBS and gentamicin release within the first day was 165.2 g/ml, which maintained a low release rate in the following days. After 28 days, gentamicin release declined to 8.5 g/ml, which was higher than the minimal inhibitory concentration of gentamicin (2 g/ml). Conclusion The local
7、drug delivery system has good drug-release performance in vitro and may possess potential value in clinical management of osteomyelitis.Key words: nano-hydroxyapatite; poly(-hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate); polyethylene glycol; gentamicin sulfate; local drug delivery system收稿日期：2005-11-28基金项目：国家
8、自然科学基金(50272021)；广东省重点攻关项目(A302020205)Supported by National Natural Science Foundation of China (50272021) and the Key Sci-tech Research Foundation of Guangdong Province (A302020205)作者简介：王永峰(1975-)，男，在读硕士研究生，主治医师，研究方向：脊柱骨科、骨组织工程学，电话：020-84348804，E-mail: 局部药物缓释系统(drug delivery system，DDS)因其在局部能达到高的药
9、物浓度，同时血药浓度低，不造成毒副作用，为治疗骨髓炎提供了一条有效的治疗途径。首先应用于临床的局部载药系统是聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)庆大霉素珠1。本研究采用具有生物活性的纳米羟基磷灰石(nano-HA)为载药核心载体，外包裹生物相容性好且可降解聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物/聚乙二醇(PHBV/PEG)，承载硫酸庆大霉素(GM)制成nano-HA-PHBV/PEG-GM 缓释微球，研究其体外释药特性，旨在为骨髓炎的治疗提供一新型的 DDS。1 材料和方法1.1 材料nano-HA、PHBV、PEG 由华南理工大学生物工程与材料学院提供。庆大霉素标准品购自中国药品生物制品检定所，批号 303
10、26-200314。M-H 培养皿购自法国生物梅里埃，由南方医科大学珠江医院检验科提供。标准菌珠金黄色葡萄球菌 ATCC25923 由南方医科大学珠江医院检验科提供。1.2 方法1.2.1 nano-HA-PHBV/PEG-GM 缓释微球的制备1.2.1.1 nano-HA-GM 的制备 将质量比为 21(GM: nano-HA)的庆大霉素药物溶于水，与 nano-HA 混合，在超声波中分散 20 min，然后磁力搅拌 70 h。停止搅拌后，将药物和 nano-HA 的混合液冻干，得白色冻干粉 nano-HA-GM。1.2.1.2 nano-HA-PHBV/PEG-GM 缓释微球的制备 将白色
11、冻干粉nano-HA-GM 分散于 PHBV/PEG(PEG20000 与 PHBV 的质量比为 21)的二氯甲烷溶液中，冻干粉与 PHBV/PEG 的质量比为 14。然后迅速倒入到外水相中，其中含 0.4%甲基纤维素。油相与水相的体积比为 1:10，剧烈搅拌直到二氯甲烷挥发完全。然后离心、过滤、水洗，收集固体冷冻干燥，制备出白色粉沫状 nano-HA-PHBV/PEG-GM 缓释微球。同法制备 nano-HA-PHBV/PEG 无药微球作为对照组。环氧乙烷消毒灭菌备用。1.2.2 电镜观察 将少量 nano-HA、nano-HA-GM 粉末和 nano-HA-PHBV/PEG-GM 微球加入
12、有适量的无水乙醇溶液中，超声振荡 10 min，然后将此悬浮液移到带微栅膜的铜网上，待乙醇完全挥发后，用 JEOLTEm2010高分辨透射电子显微镜进行分析。nano-HA-PHBV/PEG-GM 微球大小和表面形态电镜观察，微球铺在铝箔的粘性表面，微球的表面涂金后，即可在扫描电镜下观察微球形态。1.2.3 微球的载药量 取 3 个 20 mg 样品，溶于 1 ml 二氯甲烷，加入 5 ml PBS 溶液，剧烈振摇 10 min，静置 1 h，然后取上清液，按衍生化法测定 356 nm 紫外吸光度，计算出载体中药物含量平均值。1.2.4 绘制庆大霉素浓度-抑菌环直径标准曲线1.2.4.1 标准
13、庆大霉素液的配置用 pH 7.4 的 PBS 缓冲液将庆大霉素稀释成系列标准液，浓度为2000、1600、1200、800、500、200、100、50、20、10、5 g/ml。1.2.4.2 K-B 法抑菌实验取 90 mm MH 琼脂培养皿，每个平皿涂布0.5 U 浊度金黄色葡萄球菌(ATCC25923)。将直径为 6 mm 的无菌滤纸置入平皿中，每片滤纸加庆大霉素标准液 10 l，每个浓度 3 个样品，分别置于 3 个培养皿中，37 培养 24 h。游标卡尺测量各浓度抑菌环直径，取平均值。1.2.4.3 绘制标准曲线用 SPSS10.0 统计软件包拟合庆大霉素浓度与抑菌环直径的半对数标
14、准曲线。1.2.5 体外释放实验1.2.5.1 体外释放试验2取 3 个小瓶，每个瓶内放置 90 mg nano-HA-PHBV/PEG-GM 微球，加入 0.1 mol pH 7.4 的 PBS 液 1 ml，37 下浸泡 24 h。吸除浸出液，药粒用 PBS 冲洗 3 次，更换 PBS 液，继续浸泡。按浸泡后第 1、3、5、7、10、14、21、28 天留取浸出液，-30 存放。等量 nano-HA-PHBV/PEG 微球浸兆方法如上。1.2.5.2 抑菌实验按制作标准曲线的方法进行抑菌实验，游标卡尺测量抑菌环直径。1.2.5.3 绘制释放曲线用标准曲线计算出各标本药物浓度，用SPSS10
15、.0 统计软件包绘制微球释药浓度与时间关系曲线。2 结果2.1 电镜观察结果和微球的载药量2.1.1 电镜观察结果 在透射电镜下可见：nano-HA 为纳米相晶体颗粒，尺寸为 2060 nm(图 1)，nano-HA-GM 由于晶体自然凝聚以及庆大霉素药物颗粒叠加在一起成为所谓的“二次颗粒”，其大小在 100300 nm (图 2)，nano-HA-PHBV/PEG-GM 微球透射结构为 PHBV/PEG 膜包裹纳米级 nano-HA-GM 药粒形成微球(图 3)。扫描电镜观察：制备的微球呈白色，形态大小均匀规整，微球粒径为 5100 m，微球表面形态一致，表面为多孔呈皱缩结构(图 4)。 图
16、 1 nano-HA 高分辨透射电子显微像Fig.1 Observation of nano-HA under high-resolution transmission electron microscope图 2 nano-HA-GM 高分辨透射电子显微像Fig.2 Observation of nano-HA-GM underhigh-resolution transmission electron microscope图 3 nano-HA-PHBV/PEG-GM 微球高分辨透射电子显微像Fig.3 Observation of nano-HA-PHBV/PEG-GM microsphe
17、re under high-resolution transmission electron microscope图 4 nano-HA-PHBV/PEG-GM 微球扫描电镜下表面形态观察Fig.4 Morphology of nano-HA-PHBV/PEG-GM under high-resolution scanning electron microscope(Original magnification:1 000)2.1.2 载药量微球的载药量为 8.6%。2.2 标准曲线根据实验结果绘制庆大霉素标准曲线，方程为：y=8.909x-1.041，r=0.998。2.3 体外庆大霉素浓度
18、的测定3 个试样中庆大霉素均能从药棒向 PBS 液中扩散，具有明显缓释作用。第 1 个 24 h 释放量最大，达 165.2 g/ml，以后逐渐减少，但 2 周时释放量又增大，为 46.8 g/ml，其后以较低浓度维持，第 28 天仍有 8.5 g/mL 庆大霉素释放量，高于金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度(2 g/ml)。对照组无药物释放。3 讨论3.1 载药材料的选择DDS 传统的载体材料主要可分为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、无机盐材料、骨移植材料等。PMMA 是最早被用作局部缓释药物的载体，曾被广泛的应用，在体内不降解，需二次取出，限制了其应用范围。目前应用的无机盐载体主要是生物陶瓷，常用的
19、有羟基磷灰石陶瓷、磷酸三钙等。生物陶瓷主要的优点是其结构和骨相似，高的组织相容性，缺点是硬度大，不易塑型。骨移植材料包括自体骨、异体骨、异种骨，在成骨方面有着人工材料无法比拟的优势，但来源有限而且异体骨、异种骨有排斥反应。为探寻新型的 DDS 载体材料，本研究研制了一种具有 nano-HA 与 PHBV/PEG 复合体材料的 DDS。HA 为天然骨组织中主要的无机盐成分，有成骨活性，而且纳米 HA 有很大的比表面，因而有很强的吸附和承载药物的能力。常用的多聚物有聚乳酸(PLA、PLLA)、聚乙二醇(PEG)、聚羟基丁酸酯羟基戊酸酯共聚物(PHBV)等，它们有良好的组织相容性，可降解，具有弹性，
20、降解速度通过改变多聚物的亲水性和晶体结构来控制。由于这些特点，PHBV、PEG 制成的 DDS 具有良好的药物缓释性能34。因此，该 DDS 符合治疗骨髓炎理想的 DDS 载体材料所应有的特点：良好的组织相容性、载药和缓释性能及成骨活性5。3.2 体外释药的特点治疗骨髓炎要求系统使用抗生素时间应该达到 46 周6。该 DDS 在体外释药过程中无明显的突释现象，此特性可避免体内释药时全身毒副作用的发生，药物浓度随天数逐渐减小，同时有稳定的低浓度释药，释药时间达 28 d 以上。2 周时药物浓度又升高，原因可能为 PHBV/PEG 缓释膜溶胀后孔隙增大，从而导致药物释放的加速。该 DDS 微球之所
21、以能保持长时间的药物缓释，与它的结构有关。nano-HA- PHBV/PEG-GM 缓释微球存在特殊结构：首先微米级球体内包含着纳米级药粒，由于微米球粒径远大于纳米球，在释药过程中药物透过球体路径较多，导致药物释出时间延长7；其次内部 nano-HA 吸附作用会使药物释放速度缓慢，同时 PHBV/PEG 膜保证了水分进入和药物缓释，在微观结构上就形成了一个 DDS 单元，每个单元都具有载药缓释的基本性能，能有效地避免药物突释，保持长时间的药物缓释。3.3 应用前景DDS 对模药的要求较为严格，抗菌剂应具有抗菌谱宽、亲水性、不良反应小以及对热稳定等特点8，以适应制造工艺要求。nano-HA-PH
22、BV/PEG-GM 缓释微球制备过程简单，相对来说，拓宽了对抗生素的选择范围。基于慢性骨髓炎常为多种细菌感染引起，在进一步研究中，模药可选取更多抗菌谱广、效力强而毒副作用小的抗菌药物，例如氨基糖苷类、-内酰胺类、喹诺酮类以及万古霉素等药物9，以提高 DDS 对骨髓炎的治愈率。目前已研制的 DDS 形态许多为块状，实际应用中难以与骨腔完全贴敷，从而残留死腔，为骨髓炎的复发创造了条件。nano-HA-PHBV/PEG- GM 微球因体积小，在临床应用可以完全充填骨髓炎病灶残腔，以便于更充分的在局部释放有效的药物浓度，从而有广泛的应用前景。参考文献：1Buchholz H, Chekofsky K,
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