1、2005, 39( 2) : 33 37/ 朱良全, 等 中国兽药杂志 33猪瘟疫苗研究进展及我国传统疫苗的研究现状朱良全 1, 彭 隽 2, 王 栋 1( 1. 中国兽医药品监察所, 北京 100081; 2. 中国农业大学, 北京 100094) 收稿日期 2004 08 11 文献标识码 A 文章编号 1002 1280( 2005) 02 0033 05 中图分类号 S859. 797- 01 摘 要 简要介绍了国内外传统猪瘟疫苗和新型猪瘟疫苗的研究进展, 着重对我国猪瘟传统 疫苗的特点、生产工艺、生产和应用中的问题进行了概述, 并对猪瘟疫苗研究做了展望。 关键词 猪瘟; 疫苗; 现状
2、; 展望猪瘟是由猪瘟病毒( Classical swine fever virus, CSFV) 引起的一种高度接触性传染病, 也是世界粮 农组织和各国政府密切关注的主要传染病之一, OIE 国际委员会 国际卫生法典 ( 2002 版) 中, 猪瘟 被列为 A 类 15 种法定传染病之一。在我国也被列 为一类传染病。近年来, 该病在美洲、亚洲、欧洲等 国家和地区呈现散发的趋势, 一些宣布已消灭猪瘟 的国家如法国、荷兰、德国、比利时等又见猪瘟复发 的报道 1 。近几年我国因各种疾病死亡的牲猪占 饲养总数的8% 10% , 其中 1/ 3 由猪瘟致死, 每年 的经济损失高达数十亿元, 造成了巨大的
3、人力和资 源浪费 2 4 。针对我国畜牧业生产现状, 采取疫苗 防制仍是预防猪瘟的主要措施, 因而研制开发安 全、高效、稳定的猪瘟疫苗仍是当前兽医科研工作 的重点。1 传统疫苗自 1903 年 De Schweinitz 和 Dorset 首次证明CSFV 是一种滤过性病毒以来, 人们采用各种免疫 方法预防和控制猪瘟。1908 年匈牙利 H utyra Koves 制成猪瘟高免血清后 , 人们一直用高免血清 - 血毒同时肌注来免疫猪群。但由于高免血清昂贵, 获取困难, 加之血毒有散毒的危险, 因此各国学 者在以后的 60 年间相继研制出许多灭活疫 苗 2, 5 。其中福尔马林和结晶紫灭活苗曾被
4、广泛 应用。灭活疫苗虽然安全, 但保存期短。20 世纪 70 年代, 在佐剂和病毒培养技术发展的推动下 , 人 们在研制出较为理想的灭活疫苗 6 的同时, 还研制出安全有效的猪瘟弱毒疫苗, 并广泛应用于临床。 猪瘟弱毒疫苗由猪瘟野毒株弱化获得, 如中国 C 株、日本 GPE 株、法国T hiverval 株等都是广泛应用 的 CSFV 疫苗株, 一般均可提供终生免疫。中国培 育的 C 株是国际上公认的安全有效的疫苗株, 该毒 株免疫原性好、免疫谱广、安全性高、遗传性稳定。 但也有研究认为 C 株可发生垂直感染 7 。中国 C 株是中国兽医药品监察所周泰冲等研 究者自 1954 年开始 , 相继
5、用 4 株猪瘟病毒( hog cholera virus, HCV) 分别诱发家兔感染, 经过一系 列的试验, 终于选育出一株能够适应家兔的H CV, 经兔体连续传代适应后发生变异, 减弱对猪的致病 力, 却仍保持很强的免疫原性。用其制备的疫苗自 1956 年开始在全国推广应用, 对控制我国猪瘟 ( HC) 的流行起到了决定性作用, 并在国外广泛应 用。世界公认中国 C 株兔化弱毒的突出优点是 , 用 其接种的猪不产生病毒血症和脑炎病变 , 可以安全 地免疫接种任何怀孕期的母猪和吮乳仔猪, 不影响 受精率及存活率, 不引起流产、死胎, 可安全地用于 建立种猪群。2 新型疫苗2. 1 重组疫苗
6、以无致病力或低毒力的痘病毒 (VAC) 和伪狂犬病毒( PRV ) 为载体, 将猪瘟病毒 E2 基因与之重组研制出的基因重组疫苗, 免疫动 物后可对 2 种病毒产生良好的保护力。Rum enapf 等 8 将编码 CSFV 结构蛋白的 E2 基因插入痘病毒 的 TK 基因中, 获得了能表达该结构蛋白的重组痘作者简介: 朱良全( 1978 年 ) , 男, 硕士, 从事兽医微生物与兽用生物制品研究。34 中国兽药杂志 2005, 39( 2) : 33 37/ 朱良全, 等苗病毒, 将这种重组病毒免疫猪, 可使猪抵抗强毒 攻击。随后M atthias 等 9, 10 发表了猪瘟 E2 基因重 组
7、痘病毒疫苗的相关研究, 澳大利亚学者 Ham-mond 等 11, 12 相继发表了将 E2 基因重组到腺病毒 后免疫猪的文章。Mulder 等 13 指出, 伪狂犬病毒 是另一个重要的活病毒载体, 外源基因可稳定地插 入其 DNA。荷兰学者 van Zijl 14 和 Peetes 等 15 都报道了将 E2 基因重组到伪狂犬病毒中 , 免疫猪可 以抵抗猪瘟和伪狂犬病毒的攻击。我国四川农大 郭万柱教授研制的伪狂犬/ 猪瘟活载体重组疫苗也 显示出了良好的势头。重组疫苗的安全性和实用 价值目前还有争议, 因为人类至今还不了解病毒自 然发生变异的机制。一方面, 对于 VAC/ HCV 重组 体来讲
8、, 引起人们疑虑的是痘病毒会引起未种痘疫 苗人群的感染, 并使极少数感染者发病 ; 另一方面, 伪狂犬病是一种较为普遍的疾病 , 猪瘟- 伪狂犬病 毒重组疫苗对于已感染或已免疫的动物不能产生 保护力。2. 2 亚单位疫苗 亚单位疫苗因其良好的安全性 和稳定性而备受研究者青睐。CSFV 亚单位疫苗 的研制是基于对 CSFV 保护性抗原的深入研究, 其 产品已被载入 欧洲药典 , CSFV 编码的 E2 和 E0 蛋白是其主要保护性抗原, 均能独立诱导机体产生 中和抗体, 保护机体免受强毒攻击。荷兰学者 Hulst 等 16 将 E2 基因与杆状病毒重组 , 并在昆虫 细胞 Sf21 中成功表达,
9、 免疫 20 g 表达的 E2 蛋白可以保护被免疫猪免受强毒的攻击。荷兰学者Bouma 等 17 19 确定将表达的 32 g E2 蛋白为 1头份疫苗, 对猪的保护率可达 95% , 保护期达18 个 月。de Smit 等 20 研究了 E2 亚单位疫苗的保护期, 发现 E2 亚单位疫苗一免后可提供 6 13 个月 的保护力。他又进一步研究了 E2 亚单位疫苗一免 和二免后对 CSFV 温和型毒株的保护情况, 发现用 E2 亚单位疫苗标准滴度一次免疫就能显著减少温 和型毒株从带毒妊娠母猪向胎儿的传播, 二免后 4 周攻毒可阻止病毒胎盘传播。目前国际上兴起了所谓标记疫苗( Marker va
10、c-cine) 。该疫苗就是对猪瘟兔化弱毒进行改造, 使其 缺失某一段基因( 如 E0) 或某一段特殊片段( 如 E2) , 但其免疫原性不改变。以缺失的基因所表达 的蛋白作为诊断抗原, 能够区别疫苗接种猪和自然 感染猪产生的抗体。荷兰学者 de Smit 等 21 将 C株重组克隆出 Flc2 和 Flc3 重组疫苗株, Widjojoat-modjo 等 22 报道利用猪瘟 C 株感染性拷贝在 SK6c26 细胞系上连续传代, 制备了 2 株 E0 基因突 变株 Flc22 及 Flc23, 荷兰学者 van Gennip 等 23 报道制备了 3 株 C 株 E2 基因突变株 Flc4、
11、Flc47 及 Flc48。荷兰学者 de Smit 等 24 又报道构建了 2 株C 株 E2 基因突变株 Flc9 和 Flc11。他们构建的很 多突变株可以抗猪瘟强毒的感染。Dew ulf 等 25 研究了 E2 亚单位标记疫苗在实验条件下的免疫保护 情况。An 等 26 发现, 在 E2 亚单位标记疫苗中融入细胞因子有可能进一步提高疫苗免疫效果。 2. 3 核酸疫苗 DNA 疫苗技术是近年发展起来 的一种新的疫苗研制技术, 它将连接有猪瘟病毒主 要保护性抗原 E2 基因的表达载体直接免疫动物, 使病毒核酸在动物机体内进行表达, 从而刺激机体 产生免疫保护。解放军军需大学余兴龙等 27
12、已用 猪瘟 DNA 疫苗成功保护了猪对猪瘟强毒的攻击, 他们构建了 4 种包含 E2 全基因序列的真核表达质 粒, 其中用 pCDSW 质粒( 含有 5 信号序列) 给小鼠肌肉注射后可诱导小鼠抗 CSFV 的体液免疫。H amm mond 等 28 用表达 CSFV E2 基因的裸露质 粒 DNA 免疫 6 周龄断奶仔猪和 7 日龄提前断奶乳 猪, 再将这 2 组猪群均用表达 E2 基因的腺病毒重 组体( rPAV- gp55) 加强免疫一次 , 用 CSFV 攻毒后, 100% 的仔猪和 75% 的乳猪获得保护。Andrew等 29 也证明用编码 CSFV E2 基因的质粒免疫猪 后可获得保
13、护。M arkow ska- Daniel 等 30 报道 CS-FV DNA 疫苗免疫猪后能完全保护强毒攻击, 但攻 毒后有 2 d 体温高达 40 以上, 同时 T 、B 淋巴细 胞活性轻微增强。3 我国猪瘟疫苗生产工艺中存在的问题3.1 传统猪瘟兔化弱毒疫苗的生产工艺发展历程我国在 1957 年开始推广猪瘟兔化弱毒疫苗, 最初提倡就地制苗, 就地使用。继而研制真空冷冻干 燥疫苗成功, 集中生产, 统一供应。冻干苗便于保 存, 成为我国防制 HC 的有力工具。开始时采用家 兔淋脾组织制苗, 每只家兔所制疫苗可供 300 头猪 免疫。1964 年将猪瘟兔化弱毒接种乳兔 , 研制成 功乳兔苗,
14、 对猪仍保持较好的免疫原性和弱毒性。 每只乳兔所制疫苗可供 1 500 头猪使用, 大大提高 了产量, 降低了成本 , 自 1965 年起在全国推广使 用。接着又用猪瘟兔化弱毒接种牛, 病毒可在牛体 内繁殖, 淋脾毒价可达到乳兔水平, 便于就地制苗 或生产厂制造冻干苗。在偏僻山区用牛生产牛体2005, 39( 2) : 33 37/ 朱良全, 等 中国兽药杂志 35反应苗深受欢迎。1974 年黑龙江兽医研究所用原 代猪肾细胞培养猪瘟兔化弱毒制苗, 获得成功, 但 不能适应于规模化生产的需要。1975 年开始由中 国兽医药品监察所组织全国兽医药品生产厂进行 病毒型疫苗转为细胞培养制苗的技术革新,
15、 将猪瘟 兔化弱毒接种原代肾细胞进行工厂化制苗。1978 1980 年, 有 13 家兽用生物药品厂生产猪肾细胞 苗, 并用细胞毒配制猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联冻干 苗, 在全国大量使用。1980 年我国研制成功绵羊 肾细胞苗, 1982 年研制成功奶山羊肾细胞苗 , 1985 年生产出犊牛睾丸细胞苗, 为 HC 疫苗生产开辟了 一条新的道路。羊肾和犊牛睾丸细胞苗接种猪后 3 d 可产生免疫力, 5 d 可产生坚强的免疫力, 免疫期 均达到一年。王栋等发明了耐热冻干保护剂配方 和制造耐热冻干活疫苗的技术, 获得发明专利, 使 我国猪瘟耐热冻干苗达到国际水平。3. 2 传统疫苗的特点 猪瘟疫苗的质
16、量 32 涉及 两方面的问题: 一是猪瘟兔化弱毒的免疫原性, 免 疫原性是由最小免疫保护剂量和刺激机体产生的 抗体水平决定的, 兔化弱毒对兔感染的主要标志是 发热反应, 无临床症状及病理变化, 即使传至 935 代, 经鉴定免疫原性亦无改变; 二是猪瘟疫苗的使 用时的质量( 毒价) , 涉及到制苗中的质量、出厂运 输冷藏保管的质量和注射疫苗操作技术的影响等 3 个方面的问题。3. 3 传统猪瘟疫苗生产中存在的问题3. 3. 1 猪瘟细胞毒生产中, 病毒增殖过程中释放 于营养液中的病毒粒子部分失活。猪瘟病毒在 37 的半衰期为 3 h。在转瓶生产中, 病毒粒子成 熟后从细胞中释放到营养液里, 会
17、导致部分病毒粒 子失活。因此降低病毒对温度的敏感性是提高疫 苗质量的重要因素。3. 3. 2 CSFV 一般不使培养细胞产生病理变化(Cytopathic effect, CPE) 。在体外培养的细胞中 , CSFV 以低水平增殖, 产生的子代病毒滴度较低。 这是当前生产中影响疫苗质量的关键问题。3. 3. 3 在猪瘟细胞苗生产过程中, 4 收以后细胞明 显老化, 毒价降低; 6 收以后毒价难以达到配苗要求。 3. 3. 4 抗原保存和疫苗冻干过程中病毒粒子的失 活也是制约疫苗质量的因素之一。据报道, 在某个 猪瘟疫苗接种点观察, 早上稀释效价为 150 个兔体 反应量的合格疫苗, 于室温条件
18、下到晚上 8 时就只 有15 个兔体反应量, 效价损失达 90% ( 已失效) 。3. 4 传统猪瘟疫苗应用过程中存在的问题3. 4. 1 国际上要求猪瘟疫苗应达到每头份 400 RID, 才能刺激机体出现亚临床症状, 产生保护性 抗体。由于我国猪瘟细胞苗生产工艺的限制, 毒价 含量偏低, 每头份含量仅为 150 RID。3. 4. 2 我国猪瘟细胞苗生产中用犊牛睾丸细胞培 养收获细胞毒, 效检用 5 万倍兔检通过为合格, 而 按国际标准应 13 万倍兔检通过 , 犊牛睾丸细胞培 养难以达到这一标准。在兽医部门进行临床疫苗 免疫测试时, 用 1 头份疫苗免疫后, 只要对攻毒能 临床保护, 即算
19、通过, 这一标准远低于国际标准, 导 致免疫剂量不足使免疫水平达不到保护性亚临床 感染的水平, 以至于出现隐性感染猪瘟。3. 4. 3 猪瘟传统细胞苗需 - 15 保存, 目前养猪 业的生产条件很难达到这一要求。4 猪瘟疫苗研究展望4. 1 发展亚单位标记疫苗, 建立鉴别试验 如将 传统 C 株病毒的某一基因用相应的牛病毒性腹泻 病毒的基因代替, 或者牛病毒性腹泻病毒的 E2 基 因被有毒力的猪瘟病毒 E2 基因代替, 或者直接开 发 DNA 疫苗进入宿主细胞后表达 E2 基因, 或者将 突变的 E2 基因删除。4. 2 病毒保护剂研究 在细胞苗半成品生产中加 入病毒保护剂, 提高疫苗生产质量
20、。其重点在于 : 解决收获液中病毒效价的降低, 以及配苗前冷冻 保存中病毒效价的降低问题; 降低疫苗对温度的 敏感性, 延长冷冻保存时间和冻干保存期。4. 3 耐热冻干保护剂研究 选择适宜的耐热冻干 保护剂使生产的疫苗产品具有抗过敏、疫苗免疫原 性高、可常温保存等特点。4. 4 免疫佐剂及稀释液研究 开发出与传统猪瘟 疫苗相配套的免疫佐剂和稀释液, 提高其免疫效 果。4. 5 新工艺 在传统猪瘟细胞苗生产中 , 研制、筛 选和应用高通量、大规模生产的生物反应器, 将替 代常规转瓶培养, 为细胞苗的生产带来新的飞越。 4. 6 产业化 新型疫苗的研究和开发须向低成 本、高产率、更安全的产业化方向
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42、bstract: A review on classical sw ine fever ( CSF) vaccine research at home and abroad w as g iven. It includedtraditional vaccine, recombinant vaccine, subunit vaccine and DNA vaccine in brief . The characteristics and productive process of the traditional vaccine, and the problems in the productio
43、n and applications of CSF vac-cine in our country w ere discussed. An advance of CSF vaccine w as also dealt w ith in the article.Key words: classical sw ine fever( CSF) vaccine; traditional vaccine; modern vaccine农业部召开专家研讨会商讨高致病性禽流感防控对策近期, 越南、泰国、马来西亚等亚洲周边国家再次发生高致病性禽流感, 对我国形成较大威胁。对此, 农业部高度重视 , 及时向各地
44、通报境外疫情, 要求各级农业行政主管部门的广大干部职工, 结合开展保持 共产党员先进性教育活动, 进一步提高对禽流感防控工作重要性的认识, 全面部署, 加大免疫工作力度, 加 强督查, 防堵境外疫情传入, 切实落实禽流感防治工作各项措施。2005 年 1 月 24 日, 农业部在北京组织召开高致病性禽流感防控对策专家研讨会 , 农业部杜青林部长 出席了会议。会议邀请国家禽流感参考实验室、国家动物流行病学研究中心、中国农业大学、华中农业大 学、华南农业大学、扬州大学等科研单位和大专院校的禽流感防治专家, 对当前禽流感疫情形势进行了深 入分析, 对禽流感防控对策进行了研讨。专家们认为, 我国目前采
45、取的防控措施是积极有效的, 对控制高 致病性禽流感的发生与流行起到了重要的作用。会上, 杜青林部长指出, 当前周边国家高致病性禽流感疫情再次暴发, 我国禽流感防控工作面临的形 势十分严峻。我们要按照 加强领导、密切配合, 依靠科学、依法防治, 群防群控、果断处置 的方针, 进一步 提高认识, 统一思想, 增强责任感和使命感, 把高致病性禽流感防控工作抓紧、抓好、抓实。会上, 杜青林部 长强调了 四个加强 。一是加强免疫工作, 提高免疫密度。要求加强重点区域的水禽和养禽场, 特别是对 种禽场、规模蛋禽场禽只的免疫工作, 免疫密度必须达到 100% 。二是加强督查监管和联防联控, 落实领导 责任制
46、和责任追究制。加强对活禽交易市场和活禽运输环节的监管, 协调有关部门, 加强对边境地区禽类 及其产品的检疫监督, 防止境外疫情传入。三是加强应急管理, 提高应急反应能力。进一步制定和完善应 急预案 , 做到有预测、有预警、有预案, 并做好疫苗、消毒药品等防疫物资的储备, 增强应急工作的主动性和 针对性。一旦发生疫情, 能够按照 早发现、早报告、快反应、严处理 原则, 确保各项措施能够迅速到位 , 及 时组织扑灭疫情, 避免扩散蔓延。四是加强政策宣传, 提高全社会防范意识。通过各种形式, 做好禽流感 防控知识的宣传, 使广大群众了解禽流感防治的基本知识和政策方针 , 坚定禽流感是可防可控的信心, 自 觉提高防范意识, 实行群防群控。摘自 中国农业信息网