1、蛋白酪氨酸磷酸化参与调控主动脉平滑肌细胞容积调节性氯通道电流中国药理学通报 ChineseP“r,nfozogf 口 zBulletin2004May;20(5):5037?503?论着蛋白酪氨酸磷酸化参与调控主动脉平滑肌细胞容积调节性氯通道电流*周家国丘钦英贺华庞瑞萍朱邦豪黎小妍周圆关永源(中山大学中山医学院药理学教研室,广州 510089)中国圈书分类号 R 一 332;R322.12l;R322.74;R329.25;R345.57;R348.4文献标识码 A 文章编号 lOOl 一 1978(2004)05050305摘要目的探讨蛋白酪氨酸磷酸化在胚胎鼠主动脉平滑肌细胞系 A10 细胞
2、容积调节性氯通道电流中的调控作用 .方法膜片钳全细胞记录技术.结果在 A10 细胞,低渗溶液激活一外向整流电流,该电流在正电位(60mV)时缓慢失活.其反转电位为(一 1.53.4)mV,接近 Cl 平衡电位(Ecl=0mV).降低胞外 cl 浓度其反转电位随之变化.高渗溶液可抑制该电流.DIDS(100mol?I) 电压依赖性抑制容积调节性氯通道电流,在+80mV 和-80mV 的抑制率分别为 53.76.2 和 29.84.9.酪氨酸激酶抑制剂 genistein(30mol?I)抑2003 一 O9 一 l6 收稿,20031217 修回国家自然科学基金,No30271503;中华医学会
3、基金(CMB).No00730;国家教委博士点基金资助,No20020558055;广东省自然科学基金团队项目资助中山大学第一附属医院消化内科.广州 510089作者简介:周家国,男,32 岁,博士生.研究方向:心血管药理.Tel:02087330554,E-mail:;关永源,男,56 岁,博士生导师研究方向:心血管药理.通讯作者.Tel:020 87331857.Email:制该电流,在+80mV 和一 80mV 对其抑制率分别为62.3l1.3 和 66.910.5,其抑制作用无电压依赖性.酪氨酸磷酸酶抑制剂 sodiumorthovanadate(Na.VO,500“mo 卜 L-1)
4、增强该电流,其作用无电压依赖性,在+80mV 和一 80mV 电流幅度分别增加了 44.814.5 和 47.113.6.结论 AlO 细胞上存在有容积调节性氯通道.蛋白酪氨酸磷酸化参与调节 AlO 细胞容积调节性氯电流的激活.关键词主动脉平滑肌细胞;容积调节性氯通道电流;膜片钳全细胞记录;蛋白酪氨酸激酶;蛋白酪氨酸磷酸酶容积调节性氯通道(volumeregulatedchloridechannels)广泛分布于哺乳动物组织和细胞,在调节细胞容积,增殖,分化和凋亡以及维持细胞膜电位和胞内酸碱平衡等过程中起重要作用.近年来的研究表明一些胞内调节因子如蛋白,花生四烯酸及其代谢产物,蛋白激酶 C,蛋
5、白激酶 A,钙/钙调蛋白激酶,蛋白酪氨酸激酶以及细胞骨架等均参与调节容积调节性氯通道开放1, 但其具体的活化和调控机制还远未清楚.而且迄今未观察到一种普遍存在的调控机制.Newpathwayofatheroscleroticdrugtherapyanti-inflammatoryeffectIINRong,GANWeiJie,LIUJun-Tian(DeptofPharmacology,MedicalSchoolofXianJiaotongUniversity,Xian710061)ABSTRACTThereareincreasingexperimentalevidencesandclinic
6、aldatashowingthatinflammatoryreactionplaysanimportantroleintheproductionanddevelopmentofatherosclerosis.Inflammatoryprocesspromotestheproductionandreleaseofinflammatoryfactorsbyactivationofmonocytesandstimulationofendothelialcells,whichstimulatethemigrationandproliferationofvascularsmoothmusclecells
7、.Hydrolasesandcytokinesarereleasedfromtheactivatedandstimulatedcellstoincreaselocallesionandformather0sclerOticplaquewiththedevelopmentofinflammation.So,onthebasisofthenewpathogenesisofatherOsclerOsis,scientiststrytOinterferewithatherOsclerOsisbyantiinflammatorypathway.Thispaperreviewstheprogressofd
8、rugsagainstatherosclerosisbythemodulationofCreactionprotein.CD40-.CD40L,infectionandNFJcB.KEYWORDSdrug;inflammation;atheroscleroSiS.504.中国药理学通报 ChinPharmacol.gicnfBufti“2004May;20(5)蛋白酪氨酸磷酸化和去磷酸化反应是细胞功能调节和信号转导的重要形式.分别由蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinases,PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酶(proteintyrosinephosphatases,PTPs)所催化
9、.已有资料显示蛋白酪氨酸磷酸化参与调节延迟整流 K 通道,Caz+.激活 K 通道以及电压依赖性K 通道和 Ca 通道等的开放.近年来的研究表明,蛋白酪氨酸激酶的抑制剂可抑制心肌细胞,T淋巴细胞及内皮细胞的容积调节性氯通道电流,而蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂则可增强内皮细胞等的容积调节性氯通道电流,提示蛋白酪氨酸磷酸化亦参与了容积调节性氯通道的调控.但亦有相矛盾的报道9.本实验采用膜片钳全细胞记录技术,记录主动脉平滑肌细胞系 Alo 细胞上容积调节性氯通道电流并分析其特性;观察酪氨酸激酶抑制剂 genistein和酪氨酸磷酸酶抑制剂 sodiumorthovanadate 对容积调节性氯通道电流的影
10、响,以探讨蛋白酪氨酸磷酸化是否参与调控 AlO 细胞上的容积调节性氯通道电流.1 材料和方法1.1 试剂 DMEM/F12 培养基购自 Gibco 公司,小牛血清购自杭州四季青公司,胰蛋白酶,HEPES,EGTA,CsCl,CsOH,N-methyl-D-glucamine(NMI),L-aspartateacid,TEACI,MgATP,4,4-diisothiocyanatostilbene-2,2-disulphonicacid(DIDS),genistein,sodiumorthovanadate(Na3VO4),DMSO均购自 Sigma 公司,其余均为市售分析纯.DIDS,geni
11、stein 用 DMSO 溶解并保证 DMSO 的终浓度小于 0.1.其它药品均于使用前用双蒸水溶解.1.2 细胞培养 AlO 细胞(AmericanTypeCul-tureCollection,Rockville,MD)用含体积分数为10 小牛血清,110U?L 青霉素和 125mg?L 链霉素的 DMEM/F12 培养基 ,置于 37.C,5CO.培养箱内培养.细胞以 0.05 的胰蛋白酶消化,每 23d 传代 1 次.实验前细胞接种于直径 5mm 载玻片.1.3 全细胞电流记录接种有 A10 细胞载玻片置于灌流槽中,细胞外液以 2ml?min 流速持续灌流.以 3mol?L_.KCI 一
12、琼脂糖作盐桥 .电极用硼酸盐玻璃毛细管(Sutter,USA)经微电极拉制仪(pp-83,Narishige,Japan)分两步拉制而成.充灌电极液后电极电阻为 35MI2.待电极与细胞形成高阻封接(10GI2),稍加负压破膜后稳定 35min 开始记录.实验过程中,刺激脉冲的产生和信号采集均由 pClamp8.0 软件(AxonInstrument,USA)完成.实验中,AlO 细胞钳制于一 40mV,测试电压从一 lOOmV 到+120mV,梯度+20mV, 刺激持续时间 400ms,刺激频率 0.2Hz.电流和电压信号通过膜片钳放大器(Axopatch200B,AxonInstrumen
13、t,USA)放大,经 1322AD/DA 转换板输入并存储于计算机,供实验后分析和处理.电流大小以电流密度表示(单位:pA?pF).1.4 溶液电极液含(mmol?L):CsCl96,TEACl20,MgATP5,EGTA5,HEPES5,Dmannitol80,渗透压为 300mOsm?L_.,用 CsOH调 pH 值为 7.2.细胞外液中等渗溶液含(mmol?L):NMDGCl107,MgCI21.5,MnCl22.5,CdCI20.5,GdCI.0.05,HEPES10,葡萄糖 10,Dmannitol70,渗透压为 300mOsm?L_.,以NMDG 调 pH 值为 7.4.低渗溶液
14、230mOsm?L 为上述等渗溶液略去 D-mannitol,高渗溶液 370mOsm?L 为上述等渗溶液中再加入 70mmol?L1.Dmannitol.在低渗溶液中以天冬氨酸 (aspartate) 代替 Cl 一改变胞外 Cl 一浓度(ECl 一.), 用于观察 Eel 一.对电流的影响.1.5 统计分析实验数据以 z-I-S 表示,药物作用前后比较以配对 t 检验进行统计学分析.2 结果2.1A10 细胞容积激活 CI.-电流的特性实验中,以 Cs 代替 K 和电极内液含 20mmol?LTEA阻断 K 电流,NMDG 代替 Na 阻断 Na 电流,Mn 代替 Ca.阻断 Ca 电流.
15、AlO 细胞钳制于一40mV,测试电压从一 100mV 到+120mV,梯度+20mV,刺激持续时间 400ms,刺激频率 0.2Hz.在等渗条件下可记录到一基础电流,灌流低渗溶液(23 低渗 )后激活一外向整流电流,其电流密度从等渗条件下+80mV 和一 80mV 的(17.65.3)pA?pF 和(一 8.6-+-3.1)pA?pF 增加至(37.19.2)pA?pF 和( 一 22.46.2)pA?pF(P0.01,一 8).该电流在正电位(+60mV) 时缓慢失活.其反转电位为(一 1.53.4)mV,接近 Cr 平衡电位(E.一 0mV).高渗溶液可抑制该电流 (Fig1).低渗与等
16、渗条件下的差值电流的反转电位为(一 2.32.2)mV,亦接近 Cl 一平衡电位.当用天冬氨酸(aspartate 一 )代替 Cl 一,使细胞外Cl 一浓度从 116mmol?L 降为 39mmol?L 时,其反转电位随之从(一 0.43.3)mV 变化为(27.96.4)mV(P0.01,一 6),接近 Cl 一平衡电位28.4mV(Fig2).证明该离子通道电流为 Cl 一电中国药理学通报 ChineseP“rn0gf“Bulletin2004May;20(5)?505?流.rv 一一;lsotonic 一II-.r1r_一_?u?-L一卜,tnnf 忡 r,一一一-_-u?ll一 1_
17、-1ir一1=:卜一o 餮营露兰:甚若誊兰三蓦10.5nALloomsBU 一卜 Iso卜 Hypok-Hyper40 一?n.40l20U/mVFig1CurrentsactivatedbyhypotonicsolutioninA10vasci11sirsmoothmusclecelIIine(n=8)A:Representativecurrentsrecordinginisotonic,hypotonicandhypertonicsolution;B!Currentvoltagerelationshipsforvolumeregulatedcurrentsintheisotonic(一),
18、hypotonic(一一一)andhy pertonic(一)solutionsA【Cl】0=l16mmol?LBL0一.8ln.A.U1/pA.pr116mmol?L?39mm.1?L40.=-,40120U/mVFig2EfectofCl 一oonvolume-regulatedcurrentsinA10vasci11llrsmoothmusclecelIIine(116)A:Representativecurrentsrecordinginhypotonicsolutioncontaining116mmol?L 一 CIand39mmol?I 一 C1 一/77mmol?L 一aspar
19、tate 一,respectively;B:Currentvoltagecurvesforvolumereg ulatedcurrentsinhypotonicsolutionswith116mmol?IC1 一.(一 )and39mmol?L 一Cl 一.(一)2.2 氯通道阻断剂 DIDS 的作用 DIDS 是容积调节性氯通道相对特异性阻断剂.我们观察了 DIDS(i00“mol?L)对一 i00mV 到+12OmV 不同测试电压水平电流的抑制作用.如 Fig3 所示,DIDS明显抑制容积调节性氯电流,电流密度分别从用药前+80mV 和一 80mV 的(36.4 9.2)pA?pF和(一
20、21.8 士 7.1)pA?pF 减低为 (16.44.5)pA?pF 和(一 14.33.6)pA?pF(P0.01,一 8),其对外向电流的抑制作用大于内向电流,在+8OmV 和一 8OmV 对其抑制率分别为 53.712.3 和 29.86.9(P0.01,一 8),表现出明显的电压依赖性.0.5nA,_l00msBDIDShypotonic100umOI.L 一.蚕鋈蚕茎薹蔷 i.磊霍薯一蓄墓“F-Hypo卜 Hyp.+DIDs4O.)-一 DIDSsensitive.n2.40l2OU|Fig3EfectofDIDSonvolume-regulatedcurrentsinA10vas
21、cularsmoothmusclecellline(n 一 8)A:Representativecurrenttracingstakenfromacellunderisotonic.hypotonicandhypotonicwith100tmol?L 一.DIDSsolutions;B:Currentvoltagerelationshipsforvolume-regulatedcurr-entsinisotonic(一),hypotonic(一一),andhypotonicwith100/mol?L 一 DIDSsolutions(一).DIDSsensitivecurrents(OO)wer
22、ealsoshown2.3 酪氨酸激酶抑制剂 genistein 的作用蛋白酪氨酸激酶参与调控细胞许多离子通道的开放.在本实验中,胞外给予酪氨酸激酶抑制剂 genistein30mol?L 明显降低容积调节性氯电流,在+80mV 和一 80mV,电流密度从用药前的(42.4l1.3)pA?pF 和( 一 25.27.8)pA?pF-1 减低为(18.3 4.7)pA?pF 和(一 10.52.9)pA?pF(P0.01,一 8),其抑制率分别为 62.3l1.3%和 66.910.5,抑制作用无电压依赖性.Fig4 所示为 genistein 作用前后电流变化及其U 曲线.2.4 酪氨酸磷酸酶抑制剂 sodiumorthovanadate 的作用胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平由 PTK 和 PTP共同调节.为进一步探讨蛋白酪氨酸磷酸化和去磷酸化反应对容积调节性氯电流的调控作用,我们观察了 PTP 抑制剂 sodiumorthovanadate 对 A10 细胞上容积调节性氯通道电流的影响.Fig4 显示,sodiumorthovanadate 明显增强该电流,在+80mV.506?中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin2004May:20(5)A.isotonicI
