1、1实验一、光学显微镜的基本使用方法一、实验目的1. 了解光学显微镜的结构、原理和保养方法；2. 掌握光学显微镜的操作。二、实验要求1遵守实验室安全制度，听从指导教师安排；2认真听讲，不懂就问；3完成实验报告三、实验仪器和材料1光学显微镜、擦镜纸、香柏油、二甲苯2微生物示范片：蛙血涂片四、显微镜的结构、光学原理及其操作方法（一）显微镜的结构和光学原理显微镜分机械装置和光学系统两部分。1机械装置 （1）镜筒：镜筒上端装目镜，下端接转换器。镜筒有单筒和双筒两种。单筒有直立式（长度为 160mm）和后倾斜式（倾斜 45） 。双筒全是倾斜式的，其中一个筒有屈光度调节装置，以备两眼视力不同者调节使用。两筒
2、之间可调距离，以适应两眼宽度不同者调节使用。（2）转换器：转换器装在镜筒的下方，其上有 3 个孔，有的有 4 个或 5 个孔。不同规格的物镜分别安装在各孔上。（3）载物台：戴物台为方形（多数）和圆形的平台，中央有一光孔，孔的两侧各装 1 个夹片，载物台上还有移动器（其上有刻度标尺） ，可纵向和横向移动，移动器的作用是夹住和移动标本用。2（4）镜臂：镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。镜臂有固定式和活动式 （可改变倾斜度）两种。（5）镜座：镜座为马蹄形，支撑整台显微镜，其上有反光镜。（6）调节器：调节器包括大、小螺旋调节器（调焦距）各一个。可调节物镜和所需观察的物体之间的距离。调节器有装在镜臂
3、上方或下方的两种，装在镜上方的是通过升降镜臂来调焦距，装在镜臂下方的是通过升降载物台来调焦距，新式显微镜多半装在镜臂的下方。2光学系统及其光学原理 （1）目镜：每台显微镜备有 3 个不同规格的目镜，例如，5 倍（5 ） 、10 倍（10 ）和 15倍（15） ，高级显微镜除了上述三种外，还有 20 倍（20）的。（2）物镜：物镜装在转换器的孔上，物镜有低倍（8 、10、20 三种） 、高倍（40或 45）及油镜（100） 。物镜的性能由数值孔径（ N.A.）决定，数值孔径=n. sin/2，其意为玻片和物镜之间的折射率乘上光线投射到物镜上的最大夹角的一半的正弦。光线投射到物镜的角度越大，显微镜
4、的效能越大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。n 是影响数值孔径的因素，空气的折射率n=1，水的折射率 n=1.33，香柏油的折射率 n=1.52，用油镜时光线入射 /2 为 60，则 sin60=0.87。以空气为介质时：N.A.=l0.87=0.87以水为介质时：N.A.=1.330.87=1.16以香柏油为介质时：N.A.=1.520.87=1.32显微镜的性能还依赖于物镜的分辨率，分辨率即能分辨两点之间的最小距离的能力。分辨率用表示， （ 为波长） ，分辨率与数值孔径成正比，与被长成反比。增大数值孔A.N/61.0径，缩短波长可提高显微镜的分辨率，使目的物的细微结构更清晰可见。事实上
5、可见光的波长3（0.380.7 ）是不可能缩短的，只有靠增大数值孔径来提高分辨率。m物镜上标有：NA125、100 、 “OI”、160/0.17、0.16 等字样，其中 NA1.25 为数值孔径，100为放大倍数， “160/0.17”中 160 表示镜筒长，0.17 表示要求盖玻片的厚度。“OI”表示油镜， （即 Oil Immersion） ，0.16 为工作距离。显微镜的总放大倍数为物镜放大倍数和目镜放大倍数的乘积。（3）聚光器：聚光器安装在载物台的下面，反光镜反射来的光线通过聚光器被聚集成光锥照射到标本上，可增强照明度，提高物镜的分辨率。聚光器可上、下调节，它中间装有光圈可调节光亮度
6、，在看高倍镜和油镜时需调节聚光器，合理调节聚光器的高度和光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图像。（4）反光镜：反光镜装在镜座上，有平、凹两面，光源为自然光时用平面镜，光源为灯光时用凹面镜。它可自由转动方向。反光镜可反射光线到聚光器上。（5）滤光片：自然光由各种波长的光组成，如只需某一波长的光线，可选用合适的滤光片，以提高分辨率，增加反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等颜色。根据标本颜色，在聚光器下加相应的滤光片。4图 1.普通光学显微镜五、实验步骤及内容1低倍镜的操作（1）置显微镜于固定的桌上。窗外不宜有障碍视线之物。（2）旋动转换器，将低倍镜移到镜筒正下方，和镜筒对直。（3）
7、转动反光镜向着光源处，同时用眼对准目镜（选用适当放大倍数的目镜）仔细观察，使视野亮度均匀。（4）将标本片放在载物台上，使观察的目的物置于圆孔的正中央。（5）将粗调节器向下旋转（或载物台向上旋转） ，眼睛注视物镜，以防物镜和载玻片相碰。当物镜的尖端距载玻片约 0.50cm 处时停止旋转。（6）左眼向目镜里观察，将粗调节器向上旋转，如果见到目的物，但不十分清楚，可用细调节器调节，至目的物清晰为止。（7）如果粗调节器旋得太快，使超过焦点，必须从第（5 ）步重调，不应正视目镜情况下调粗调节器，以防没把握的旋转使物镜与载玻片相碰撞坏。（8）观察时两眼同时睁开（双眼不感疲劳） 。单筒显微镜应习惯用左眼观察
8、，以便于绘图。2高倍镜的操作（1）使用高倍镜前，先用低倍镜观察，发现目的物后将它移到视野正中处。（2）旋动转换器换高倍镜，如果高倍镜触及载玻片立即停止旋动，说明原来低倍镜就没有调准焦距，目的物并没有找到，要用低倍镜重调。如果调对了，换高倍镜时基本可以看到目的物。若有点模糊，用细调节器调就清晰可见。3油镜的操作5（1）如果用高倍镜目的物未能看清，可用油镜。先用低倍镜和高倍镜检查标本片，将目的物移到视野正中。（2）在载玻片上滴一滴香柏油（或液体石蜡） ，将油镜移至正中使油镜头浸没在油中，刚好贴近载玻片。用细调节器微微向上调（切记不用粗调节器）即可。（3）油镜观察完毕，用擦镜纸将镜头上的油揩净，另用
9、擦镜纸蘸少许二甲苯揩拭镜头，再用擦镜纸揩干。4用铅笔分别绘出各种细菌的形态图。六、数据整理七、实验过程中应注意事项及心得1.取、送显微镜时要轻拿轻放，一定要一手握住弯臂，另一手托住底座。显微镜不能倾斜，以免目镜从镜筒上端滑出。不可把显微镜放在实验台的边缘，以免碰翻落地。取拿显微镜罩子的时候也一定轻取，以免将目镜从镜筒上带出摔坏。2.显微镜的光学部分只能用特殊的擦镜纸擦拭，切忌乱用他物擦拭，更不能用手触摸透镜，以免汗液玷污透镜。3.转换物镜时，不要用手直接旋转物镜镜头，只能转动物镜转换器。4.使用高倍物镜时，勿用粗准焦螺旋调节焦距，以免移动距离过大，损坏物镜和玻片。5.调节显微镜的焦距从低倍到高
10、倍，用油镜时，直接从低倍到油镜。6.油镜使用过后应用擦镜纸蘸二甲苯擦拭干净，如此两次，第三次用干净的擦镜纸直接擦拭镜头。八、思考题1如何保养和维护好一台光学显微镜？2油镜为什么要先用低倍和高倍镜检查？先用低倍镜和高倍镜观察，可逐渐缩小视野范围，选取目的物，便于观察。6实验二、各类细胞形态的观察一、实验目的1. 了解动、植物细胞的一般形态结构特点；2. 初步掌握临时玻片标本的制备方法；3. 掌握显微测量的基本方法；4. 初步掌握光学显微镜下所见细胞、组织结构的绘图记录方法；5. 进一步掌握光学显微镜的规范使用方法。二、实验原理细胞是生命活动的基本结构单位和功能单位。构成人体和其他高等动植物的细胞
11、种类繁多，形态各异。有球形、椭圆形、扁平形、立方体、长梭形、星形等。细胞的形态结构与功能相关是很多细胞的共同特点，在分化程度较高的细胞更为明显，这种合理性是生物漫长进化过程所形成的。例如：具有收缩功能的肌细胞呈长梭形或条形；具有感受刺激和传导冲动机能的神经细胞有长短不一的树枝状凸起；游离的血细胞为圆形、椭圆形或圆饼形。高等生物体不同细胞的大小差异很大，其直径大多数在 10-100um，一般都需借助显微镜才能看到。由于细胞较小，而且其内含有较大比例的水分，故大多数是无色透明的，如果不经过染色处理，在显微镜下很难看清细胞的结构。因此，要观察细胞时，通常先进行染色处理。虽然细胞的形态、大小和功能各不
12、相同，但在普通光学显微镜下，一般可见人体及动物细胞的基本结构可分为细胞膜、细胞质和细胞核三部分。但也有例外。哺乳类红细胞成熟时细胞核消失。植物细胞的基本结构可分为细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核四部分。任何动、植物细胞都具有特定的形态结构，对其进行固定和染色等处理，便可以在显微镜下分7辨清楚，然后借用目镜测微尺和镜台测微尺，便可测量大小。三、实验用品材料与标本：洋葱、人口腔粘膜上皮细胞、人血涂片标本、神经元细胞标本仪器与器材：显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、目镜测微尺、擦镜纸、吸水纸、手术器材一套、消毒牙签、解剖盘一个、小平皿两个试剂：1%甲苯胺蓝、1%碘液，1%甲基蓝、瑞氏染液、Ringer 氏
13、液四、实验方法步骤（一）洋葱鳞茎表皮细胞的标本制备取干净载玻片，中央滴一滴 1%碘液；取洋葱鳞茎，用镊子在其内表面轻轻撕取一小块方形膜质表皮（边长 3-4mm） ，置于载玻片的碘液中，铺平。用镊子夹取干净的盖玻片，将其一侧先接触标本旁的碘液，再缓缓的盖上盖玻片，尽量避免产生气泡，用滤纸吸去盖玻片周围的液体。（二）人口腔粘膜上皮细胞的标本制备取干净载玻片，中央滴一滴 1%碘液；用一根灭菌的牙签轻轻刮取颌部任一侧的上皮。然后将它涂在载玻片的碘液中，并轻轻搅动几下使细胞分开。用镊子夹取干净的盖玻片，将其一侧先接触标本旁的碘液，再缓缓的盖上盖玻片，尽量避免产生气泡，用滤纸吸去盖玻片周围的液体。（三）蛙
14、血涂片标本观察（四）人血涂片标本观察（五）神经元细胞标本观察（六）神经元细胞标本观察四、实验结果记录（一）各类动植物细胞形态观察1. 洋葱鳞茎表皮细胞标本的观察8将制备好的临时玻片置于低倍镜下观察，可见洋葱鳞茎表皮是由许多长柱状、排列整齐且紧密的细胞组成的（图 1） 。选择其中一个较典型的细胞移至视野中央，再转换高倍镜仔细观察一下结构（图 2）：（1）细胞壁：为细胞最外层的一层由纤维素组成的较厚结构，它是植物细胞的重要特征之一。细胞膜位于细胞壁内侧并与其紧密相贴，光镜下不易分辨。（2）细胞核：位于细胞中央或者靠近细胞边缘，呈圆形或者卵圆形，染成深黄色。转动细调螺旋，在细胞核内可以看见 1-2
15、个遮光较强的核仁。（3）细胞质：细胞膜与细胞核之间的区域是细胞质，染成浅黄色。其中可以见到一至数个液泡，液泡内充满清澈明亮的液体。图 1. 洋葱鳞茎表皮细胞（100）图 2. 洋葱鳞茎表皮细胞（400）92. 人口腔粘膜上皮细胞标本的观察将制备好的口腔粘膜上皮细胞玻片标本置于显微镜下观察，先用低倍镜观察，可见呈不规则形或扁平椭圆形或多边形的细胞，单个或者多个连在一起。这就是口腔粘膜上皮细胞。选择轮廓清晰而无重叠的细胞，移至视野中央，转换高倍镜观察。高倍镜下，可清晰地看到细胞外形扁平而不太规则，中央有一卵圆形的被染成深黄色的细胞核，细胞质染成浅黄色，均匀地分布于细胞核与细胞膜之间（图 3）图 3
16、. 口腔粘膜上皮细胞（400）3. 人血涂片标本的观察将血涂片标本放于显微镜下，先用低倍镜浏览整张血涂片，选择细胞均匀分布、较少重叠、有核细胞较多的区域。然后转换高倍镜仔细观察红细胞和白细胞。人血涂片上红细胞数目最多、体积小、呈双凹盘状，无细胞核（图 4） 。细胞质呈粉红色；白细胞比例较少，寻找较困难，但细胞体积较大，细胞核明显，形态多样，呈紫蓝色。10图 4. 人血细胞（400）4. 蛙血涂片标本观察显微镜观察可见蛙红细胞为椭圆形，细胞质浅红色，细胞核呈椭圆形；白细胞数目较少，为圆形（图 5） 。图 5. 蟾蜍红细胞（400）（二）细胞大小测量选一洋葱表皮细胞，测细胞大小（长 X 宽）及核的
17、大小（直径）选一蛙红细胞，测细胞大小（长 X 宽）及核的大小（直径）11实验三、 死活细胞鉴别及细胞计数1.实验目的（1）练习使用细胞计数板进行细胞计数； （2）掌握台盼蓝染色法进行的死活细胞鉴别。2.实验原理（一）细胞计数原理 细胞密度（个/ml）=n/41000 稀释倍数 n=四大格内的细胞总数（二）台盼蓝染色原理 死活细胞鉴别有许多不同的方法，其中最常用方法是染色排除法。其原理是：许多酸性染料不12容易穿过活细胞的质膜进入胞内，使其着色，以此来鉴别死活细胞。比较常用的台酚蓝染色法，原理：细胞损伤或死亡时，由于膜的完整性丧失，通透性增加，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与细胞的 DNA 结合，使
18、其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。3.实验用品（1） 试剂：0.4%台盼蓝染液 （4%台盼蓝母液：称取 4g 台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至 100ml，用滤纸过滤，4 度保存。使用时。用 PBS 稀释至 0.4%）（2） 耗材：血细胞计数板、盖片、滴管或移液器、枪头。（3） 仪器：显微镜试剂（4） 材料：动物细胞4.实验方法1. 用 PBS 配制 0.1% 台盼蓝溶液；2. 用 0.5% 胰蛋白酶： 0.2%EDTA=1 ： 1 混合液来消化培养的贴壁细胞；3. 再加入适量 PBS 制成细胞悬液；4. 将待染色细胞稀释至所需浓度（方法及浓度范围与细胞计数相
19、同） ；5. 每 0.1ml 细胞悬液约加新鲜配制的染液一小滴（细胞悬液与 0.4%台盼蓝溶液以 9:1 混合混匀。 ） ，室温下染 35min；6. 染色过的细胞材料，取一滴细胞悬液置玻片上，加盖玻片后放高倍镜下观察；7. 死亡的细胞着浅蓝色并膨大，无光泽。活细胞不着色并保持正常形态，有光泽；8. 血细胞计数板及盖片备好； 9. 加入 20ul 悬液滴至计数板和盖片空隙中； 10.计数：在三分钟内，用计数板分别计数活细胞和死细胞结果：死细胞染成蓝色，活细胞不着13色。根据下式求细胞活力：细胞存活率 （ ） =细 胞 总 数 -死 细 胞数细 胞 总 数 100%5. 观察结果镜下观察，死细胞
20、被染成淡蓝色，而活细胞拒染。 根据下式求细胞活力： 活细胞率（%）= 活细胞总数/ （活细胞总数+死细胞总数）100 6. 注意事项： 1. 细胞悬液应充分混匀； 2. 吹打混匀细胞时不要产生气泡； 3. 计数中，不要漏记，不要重复，每个细胞悬液至少滴样两次求平均值；4. 细胞计数板不可放干，需用完即冲。5. 台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。7.思考题细胞活力检测有何用途？14实验四、细胞化学 1 Feulgen 染色一、实验目的：通过根尖压片法，掌握 Feulgen 反应显示 DNA 的基本原理和主要操作环节二、实验原理：Feulgen 反应是 1924
21、年由 Feulgen 和 Rossenbeck 开创的。这一反应的原理是：DNA 在一定的温度（60）下，被酸水解，打开嘌呤碱与脱氧核糖连接的键。在脱氧核糖的一端形成游离的醛基，醛基与 Schiff 试剂（脱色碱性品红）结合，形成紫红色化合物。所以，凡有 DNA 的部位，会呈现紫红色阳性反应，可以作为定性研究 DNA 的一种简便方法。三、实验用品：（一）、药品：1、 Schiff 试剂：称 1g 碱性品红，溶于 200ml 已煮沸的蒸馏水中（要漫漫加入，不可一下全部倒入），继续煮沸 5 分钟（搅动），然后使其冷却至 50，过滤于棕色磨口瓶中，加入 20ml 1N HCl（取比重为 1.19 的
22、 HCl 32.5ml，加蒸馏水至 1000ml 即成），继续冷却至 25时加入1g 偏亚硫酸钾（KHSO3）或偏亚硫酸钠（NaHSO3 ），将瓶塞盖严，置于暗处 24 小时，溶液应为无色，可保持在 1-4冰箱中备用。如果红色不退可加入 2g 活性炭粉末，搅动数分钟后静置数小时，再过滤即可脱去红色。152、 1N HCl：取 82.5ml 比重为 1.19 的盐酸加蒸馏水 1000ml 即成（应将盐酸缓缓加入水中）。3、 45%醋酸4、亚硫酸水溶液：在 200ml 自来水中，加入 10ml 10%的偏亚硫酸钠（或偏亚硫酸钾）溶液，或加入 10ml 30%的偏重亚硫酸钠溶液，再加入 1N HCl
23、 10ml 即成，盖紧瓶塞。此液要现配现用。5、 Carnoy 固定液：95%酒精 3 份，冰醋酸 1 份混合即可。6、 50%酒精、30%酒精。7、 5%三氯醋酸（二）、用具：显微镜、恒温水浴锅、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、酒精灯、青霉素小瓶、吸水纸等四、实验材料：洋葱根尖五、方法步骤：1、取 0.5-1cm 的根尖，在 carnoy 固定液中固定 2-24 小时。固定时以冰箱中进行为宜。2、取出固定材料，用 50%酒精、30% 酒精、蒸馏水各冲洗 5 分钟，以除掉材料上的醋酸。准备两张切片，其中一张作对照。3、水解：用 1N 的冷 HCl 过洗材料一次，然后放入温度稳定在 60的 1N H
24、Cl 中，水解 10-14 分钟，取出材料后再用 1N 冷 HCl 过一次。4、染色：将水解后的材料放入 Schiff 试剂中染色 1 小时左右，此时根尖部分会出现紫红色。5、用亚硫酸水漂洗三次，每次 5 分钟，使细胞质的紫红色退掉，再流水冲洗 515 分钟，洗后的材料放入蒸馏水中。168、用 45%的醋酸压片。9、镜检。与对照装片比较。10、对照切片的制做：进行 Feulgen 反应时， 一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片可用下面两种方法制作：1 不经水解直接放入 Schiff 试剂内染色。2 材料固定后用 5%三氯醋酸于 90 处理 15min，用蒸馏水冲洗，以后步骤同实验组。六
25、、注意事项：1、 Feulgen 反应的染色深浅与材料、水解时的温度和时间都有关系。水解时间的长短要根据固定液和材料来进行选择，时间太短则游离的醛基量少而染色不深，时间太长会因醛基进一步变成其它物质，染色也不深。水解时的温度要严格控制。2、未经水解的对照切片在 Schiff 试剂中最多不要超过 1 h （0.5 h 即可），时间过长，试剂本身的酸性也会使 DNA 水解，从而出现假的正反应。3、 Schiff 试剂的作用 ：Feulgen 反应成功与否的一个非常关键的因素，就是 Schiff 试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA 染色
26、反应用”的碱性品红才行。此外，Schiff 试剂的配制方法也可影响 DNA 的染色反应。七、作业：1、绘图表示 Feulgen 反应的染色结果， 并验交 Feulgen 反应的压片 1 张。2、总结 Feulgen 反应染色结果的影响因素。3、 Feulgen 反应的实验原理是什么？4、在稀盐酸水解后，为什么要用亚硫酸水洗片？17实验五、 细胞骨架制备与观察一、 实验目的1、 了解动植物细胞骨架结构特征及其制备技术。2、 掌握考马斯亮蓝 R250 对动植物细胞骨架染色的方法。二、 实验原理细胞骨架（cytoskeleton）是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微
27、管、微丝和中间纤维。他们除了对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起到重要作用外，还参与许多重要的生命活动。如：在细胞分裂中细胞骨架牵引染色体分离，在细胞物质运输中，各类小泡和细胞器可沿细胞骨架定向运转；在肌肉细胞中，细胞骨架和它的结合蛋白组成动力系统；在白细胞（白血球）的迁移、精子的游动、神经细胞的轴突和树突等方面都与细胞骨架有关。另外，在植物细胞中细胞骨架指导细胞壁的合成。目前研究细胞骨架的主要方法是应用高压电镜或免疫荧光显微技术等。细胞骨架在通常固定情况下不稳定，如低温、高压、酸处理等。当采用适当的手段，如 M-缓冲液洗涤细胞，可以提高细胞骨架的稳定性，戊二醛在室温下
28、能较好的保存细胞骨架的成分，另外，Triton X-100 处理能抽取掉一部分杂蛋白，可使骨架成分显现的更加清晰。本实验用考马斯亮蓝18R250 显示各种骨架蛋白，因为骨架纤维成束分布，结构惊考马斯亮蓝 R250 染色以后，有夸大作用。由于微管的结构不稳定，部分纤维太细，光镜下无法分辨，因此，我们看到的主要是微丝组成的应力纤维。三、 实验材料（一） 器材：洋葱鳞茎若干、人口腔上皮细胞、光学显微镜、电子天平、0.02 移液枪、50ml 烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镊子、消毒棉签、水浴锅（二） 试剂：1. PB (PH7.3) :0.02mol/L Na2HPo4 77ml0.
29、02mol/L Na2HPo4 23ml2. 0.01mol/L PBS (PH6.5)0.2mol/L PB 50ml0.15mol/L Nacl 50ml 双蒸馏水加至 1000ml3. M-缓冲液（PH7.2）各成分终浓度为：咪唑 50mol/LKcl 50mol/LMgcl2 0.5mol/LEGTA 1mol/LEGTA-Na2 0.1mol/LDTT 1mol/L4. 1%的 Triton X-100：Triton X-100 1ml19M-缓冲液 99ml5. 0.2%考马斯亮蓝 R250 染液考马斯亮蓝 R250 0.2g甲醇 46.5ml冰醋酸 7ml蒸馏水 46.5ml6.
30、 3%戊二醛 100ml25%戊二醛 12mlPBS 88ml四、 实验步骤（1） 取材：取洋葱鳞茎内表皮 2-3mm 置于滴有 PH6.8 磷酸缓冲液（PBS）的载玻片上，使其充分润湿。（2） 去垢：吸去 PBS 缓冲液，用吸水纸吸净。取 2-3 滴 1%Triton X-100 处理 20-30min，为保证去垢效果，可水浴加热至 37 度。（3） 冲洗：吸去 1%Triton X-100，用 M-缓冲液洗三次，每次 3 分钟。（4） 固定：吸去 M-缓冲液，用 3%戊二醛固定 30min-60min。（5） 冲洗：吸去戊二醛，用 PH6.8 磷酸缓冲液冲洗 3 次，每次 10min。（6
31、） 染色：吸去 PBS，用 0.2%考马斯亮蓝 R250 染色 20-30min（实际用时可根据当时的室温及湿度做出相应改变） 。（7） 制片：用蒸馏水冲洗 1-2 次，展平置于载玻片上，加盖玻片。（三） 人口腔上皮细胞骨架考马斯亮蓝 R250 染色（1） 涂片 用干净牙签刮取人口腔上皮细胞，置于装有生理盐水试管中，洗涤离心 1-2 次，剩20约 0.5-1ml 上清液，吸管吹打均匀、涂片、晾干。（2） 漂洗 M-缓冲液漂洗 3 次。（3） 处理 1%Triton X-100 37 度处理 15-20min，M 缓冲液漂洗 3 次。（4） 固定 3%戊二醛固定 15-20min，PBS 洗 3
32、 次，滤纸吸干。（5） 染色 0.2%考马斯亮蓝 R250 染色 5-10min。（6） 封片 水洗制成临时片或晾干用中性树胶封片成永久片。观察：1. 将制备好的装片置于光学显微镜的低倍镜下，可见到规则排列的长方形洋葱表皮细胞轮廓（图14-1） ，细胞内可见到被染成蓝色的粗细不等的分枝状结构，这便是细胞骨架。转高倍镜观察，调节细准焦螺旋可见到细胞骨架的立体结构。2. 光镜下动物细胞形态不甚清楚，只能大概见到细胞轮廓，中间纤维呈深蓝色（图 14-2）五、 实验记录1. 洋葱和表皮细胞与人口腔上皮细胞骨架图图 14-1 洋葱内表皮细胞骨架（400x）21图 14-2 人口腔上皮细胞骨架（400x）
33、在光学显微镜下，可见在细胞核和细胞质表面分布许多排列不规则的纤维束，走向清晰，呈浅蓝色或深蓝色。但试验中，也可见到部分细胞骨架纤维并非呈纤维状，而是呈串珠状或颗粒状，这是由于在固定和 PBS 洗涤过程中，并没有将溶解下来的膜蛋白等成分去除造成的。但由于考马斯亮蓝 R250 染色是一种非特异性反应，因此此实验尚不能区别微管、微丝和中间纤维。2. 作业（1） 绘制洋葱表皮细胞与人口腔上皮细胞骨架图。（2） 光镜下观察到的细胞骨架有何形态特征？六、 注意事项：1. Triton X-100 抽提处理的时间很关键，如果处理时间太短，没有抽提掉细胞器膜上的蛋白，会造成很深的背景颜色，干扰细胞骨架的观察；
34、如果处理时间太长，会破坏骨架蛋白使骨架纤维断裂，应控制在 30min 左右。2. 每一次加液或染色后，应洗净漂洗液，并用滤纸吸干。3. 加 3%戊二醛溶液对细胞骨架和细胞形态的维持十分重要，固定时间应不低于 20min。22实验六、碱性磷酸酶的检测1.实验目的（1）学习 Gomori 钙法检测碱性磷酸酶的原理和方法（2）学习偶氮色素法检测碱性磷酸酶的原理和方法（3）观察细胞内碱性磷酸酶的分布2.实验原理碱性磷酸酶(ALP) 是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。以 ALP 为目标物的检测方法有：（1） Gomori 钙钴法；（2） ；偶氮偶联法（3 ）碱性磷酸
35、酶染色试剂盒法；（4）PNPP 偶氮法；（5）BCIP/NBT 比色法；（6）茜素红法；（7 ）von Kossa 法。（1） Gomori 钙钴法【染色原理】 ALP 在 pH 值 9.4 的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把 -甘油磷酸钠水解出磷23酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。（2）偶氮偶联法3.实验材料（1）Gomori 钙钴法【孵育液配制】 3%-甘油磷酸钠 5ml2%巴比妥钠 5ml蒸馏水 10ml2% CaCl2 10ml2% MgSO4 1ml（2）偶氮偶联法【孵育液配制】 萘酚 AS-BI 磷
36、酸盐 20mgDMSO 0.5ml0.2mol/L 巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2） 50ml六偶氮副品红 0.5ml1mol/L NaOH 调 PH 9-10，混合后过滤使用。（六偶氮副品红：副品红 400mg，浓盐酸 2ml，双蒸水 8ml 混合过滤；临用前与等体积 4%亚硝酸钠混合）4.实验方法（一）Gomori 钙钴法【步骤】24（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，待细胞长满玻片后取出。（2）PBS 冲洗后用冷丙醇固定 10min，蒸馏水冲洗数次。（3）入孵育液中，37孵育 4-6h。自来水冲洗数次。（4）2%硝酸钴中浸 3-5min，蒸馏水洗数次。（5）1%的硫化铵中 2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。（二）偶氮偶联法【步骤】（1）细胞爬片成功后，PBS 冲洗后，置入 4 10%甲醛固定 10min。（2）蒸馏水冲洗。（3）将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用 45min。（4）流水冲洗，晾干。（5）甘油明胶封固。5.实验结果【Gomori 钙钴法结果 】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。【偶氮偶联法结果】成骨细胞胞质中可见红色 ALP 阳性颗粒。6.注意事项（1）巴比妥钠是孵育液中的缓冲剂，硫酸镁为激活剂。（2）碱性磷酸酶孵育液须现配现用
