1、脂蛋白脂酶活化剂 No-1886 对抗脂毒性葡萄糖毒性及对贵州小香猪胰岛细胞的保护作用2004 年 6 月第 12 卷第 2 期中国实验动物ACTALAB0RAT0RII|MANIMAIISSCIENTIASINICAJune,2004Vo1.12No.2脂蛋白脂酶活化剂 No 一 1886 对抗脂毒性葡萄糖毒性及对贵州小香猪胰岛细胞的保护作用王宗保,席守民,廉馨,姚峰,余坚,尹卫东(1.南华大学实验动物学部,湖南衡阳 421001;2.南华大学生物化学与分子生物学研究中心,421001)【摘要】目的探讨合成化合物 No.1886 调节糖,脂代谢的作用机制及对贵州小香猪胰岛结构和功能的影响.方
2、法 34 月龄贵州小香猪 15 只,随机选取 5 只饲以基础饲料为正常对照组;5 只饲以高脂高糖饲料为糖尿病对照组;5 只前 3 个月饲以高脂高糖饲料,后 5 个月饲以高脂高精饲料加 1.0%No 一1886 为糖尿病治疗组.分别在 0,2,3,4,5,6,8 个月末时从禁食过夜的猪眶静脉安取血样,测定血浆葡萄糖,甘油三酯和血清胰岛素浓度.第 8 个月末,处死动物,每只动物取胰腺 1 小块,l0%中性甲醛液固定 ,常规石蜡包埋切片,HE染色:另一部分胰腺切片用猪胰岛素抗体作免疫组化染色,显微观察照相,并用图像分析软件 IMAGEJ 测量胰岛口细胞在胰岛中所占的面积.另取 1 小块胰腺,4,2.
3、5%戊二醛崮定,常规透射电镜样品制备,透射电镜下观察并照相.结果糖尿病对照组和糖尿病治疗组(加药前) 出现高血糖,高甘油三酯,胰岛素水平亦升高,正常对照组血糖,甘油三酯,胰岛素未见明显升高.两组比较差异具有显着性意义(P0.05);与糖尿病对照组比较,糖尿病治疗组加药后血糖,甘油三酯,胰岛素水平降低.从胰腺显微和超微结构观察及口细胞免疫染色结果看,高糖高脂饲料对贵州小香猪胰腺组织结构,p细胞结构和功能都有损伤,而 No 一 1886 对胰腺组织结构及 B 细胞结构和功能有保护作用.结论 No.1886 有降低血浆葡萄糖,甘油酯,减轻胰岛素抵抗和保护胰岛 B 细胞的作用.【关键词】葡萄糖;甘油三
4、酯;糖尿病;B 细胞;贵州 4,香猪【中图分类号】1:1587.1【文献标识码】A【文章编号】1005.4847(2004)02010305ProtectionofGuizhouMiniaturePigsIsletCeilsbytheLipoproteinLipaseActivatorNo 一 1886againstGlucotoxicityandLipotoxicityWANGZong-bao,X1Shourain,LIANXi77,YAOFeng,YUJian.YINWeidong:(1.DepartmentofLaborato,AnimalScience.2.DepartmentofBi
5、ochemistDandMolecularBiolog.,NanhuaUni,ersit),Heng5ang421001,China)【Abstract】ObjectiveToexploretheapplicationmechanismofNo 一 1886,as)nthetiecompound,adjustingglucoseandlipidmetabolismandtheeffectonthestructureandfunctionoftheisletsindiahetieGuizhouminipigsinducedbyhighfatandhighsucrosefeeding.Method
6、sFifteenGuizhouminipigsabout34monthswererandomlydividedinto3groups:similarbodyweightofNormalcontroldiet(CD),highfathighsucrosefeddiet(HFSD),andhighfathighsucrose.feddietfollowedbyNo.1886treatment(HFSD+No 一 1886).Thefastingconcentrationsofplasmaglucose,trig1)cefideandseruminsulinwereanalyzedatmonth0,
7、2,3,4,5,6,and8respeetie1).Theanimalsweresacrificedattheendofmonth8.Samplesofpancreaswerecutandfixedilll0%fonnalin,paraffinembedded,sectionedandstainedwithHE.Otherseetionswerestainedwithanantibo【1vtoDorcine;nsulin.Afterinnnuuostaining,sectionswerephotographedandtheperlcentareasoecupiedbyBcellsweremea
8、suredina11ofthethreegroupsb)plamimetr)withthesoftware1MAGEJ.Apartofpancreaswasfixedwith4,2.5%glutaraldh,_de,samDledbvnleansofnonHalelectronicmicroscope,andobsenedandphotographedundertrmsmitelectronicmicroscope.ResultsHighfat基金项目 湖南省科技厅科研项目资助(课题号作者简介 王宗保 (】965 一), 男,教授,研究方向2JZN2002).糖尿病和动脉粥样硬化动物模型及其实
9、验研究104 中国实验动物 2004 年 6 月第 12 卷第 2 期ActaLabAnimSciSin,June,2004,Vo1.12.No.2highsucrosefeedingelevatedfastingplasmaglucose,triglycerideandseruminsulinlevelssignificantly.ThesevaluesweresignificantlyhigherthanthoseinNormalcontrolgroup(P0.05).SupplementofNo 一1886intohighfathighSUCrOSedietinducedadecreas
10、einplasmaglucose,triglycerideandinsulinconcentrationcomparedwithpigsfedwiththesolehighfathighsucrosediet.TheobservationofDancreaticisletsmicrostructureandultrastructureandimmunostainingresultsofisletpcellsshowedthatthehighfatandhighsucrosefeedingdamagedthepancreatictissuesstructureandthestructureand
11、functionofthepcells.ButNo 一1886hadaprotectionofpancreatictissuesstructure,andthestructureandfunctionofpcells.ConclusionNo 一 1886suppressedplasmaglucoseandtriglyceridelevel,andalleviatedinsulinsensitivityandpcelldamageaswel1.【Keywords】 Glucose;Triglyceride;Diabetes;pcell;Guizhouminipigs合成化合物 No 一 188
12、6 是一种脂蛋白脂酶活化剂,有降低血浆甘油三酯并升高高密度脂蛋白胆固醇浓度的作用,也可减轻给予高脂饮食后患中等程度肥胖小鼠,大鼠的胰岛素抵抗.最近,我们的研究发现 No 一 1886 还有降低高脂高糖饮食诱导的糖尿病新西兰兔血糖和血脂水平的作用.在本研究中,我们主要观察了 No 一 1886 是否可降低高脂高糖饮食诱导高血糖,高甘油三酯的贵州小香猪血浆葡萄糖和甘油三酯水平,是否减轻胰腺组织病变,并改善胰岛 J3 细胞分泌胰岛素的功能.1 材料与方法1.1 材料No-1886l4-(4-bromo-2 一 cyaNo.pherrylcarbamoy1)一benzyl-phophonicacidd
13、iethylester,CAS133208932;lotNo(99H)74SM,由日本德岛 Otsuka 制药厂新药研究实验室合成.白蔗糖购自柳州糖业公司,猪油购自衡阳市肉食水产公司.基础饲料原料配方见表 1表 1 基础饲料原料配方(%)Tab.1Compositionofcontroldiet(%)成分Components百分比(%)Percent玉米 Com小麦麸 Wheatbran大豆粕 Soybeanmeal棉籽粕 Cottonseedmeal菜籽粕 Colzameal鱼粉 Fishpowder磷酸氢钙 Calciumbicarbonate骨粉 Bonepowder食盐 Salt微量元
14、素 Traceelements维生素 Vitamin64.111O.51l1.984.o04.o02.o0O.8O1.1OO.5OO.5OO.5O1.2 动物实验34 月龄的贵州小香猪(旱:舍=7:8)15 只,体重(6.02 1.29)kg/只(由第三军医大学实验动物中心提供).随机分成 3 组:5 只饲以基础饲料为 CD组(正常对照组);5 只饲以高脂高糖饲料 (含 37%白蔗糖,10% 猪油,53% 基础饲料)为 HFSD 组(糖尿病对照组);5 只开始 3 个月喂高脂高糖饲料,3 个月后至 8 个月时饲以高脂高糖饲料加 1.O%No 一 1886 为HFSD+No 一 1886 组(糖
15、尿病治疗组 ).动物喂养在 12h 昼夜交替,温度为(253)的环境,单笼饲养,饲料按体重的 2.5%计算日粮,喂食在上午 9 时,下午4 时进行,自由饮水.分别在 0,2,3,4,5,6,8 个月末,从禁食过夜的猪眶静脉窦抽取血样.实验期为8 个月.1.3 血糖测定用南京建成酶法试剂盒测定空腹血血浆葡萄糖(Plasmaglucose,Glu).1.4 血浆脂质测定采用上海荣盛生物试剂厂酶法试剂盒测定血浆甘油三酯(Plasmatriglyceride,TG).1.5 血胰岛素测定用放射免疫法测定血清胰岛素,试剂购自北京原子能研究所.1.6 统计学处理用 SPSS 软件统计分析数据,实验数据以王
16、s表示,三组数据整体作方差分析,两组比较用 t 检验,显着性意义以 P0.05 表示.1.7 胰腺组织病理学检查动物颈动脉放血处死,取胰腺,用 10%甲醛液固定,按常规石蜡切片法制样,HE 染色,光学显微镜下观察,在 JPG 软件下摄像并存入软盘 .1.8 胰岛 p 细胞免疫染色及分析取胰腺石蜡块,切片,猪胰岛素抗体染色,光学显微镜下观察,在 JPG 软件下摄像并存入软盘 .用图像分析软件 IMAGEJ 测量 J8 细胞在胰岛中占据的中国实验动物 2004 年 6 月第 12 卷第 2 期ActaLabAnimSciSin,June,2004,Vol12No.2105面积,每组动物测量 100
17、 个胰岛,数值以 x+s 表示,并计算 8 细胞所占面积的百分比.1.9 胰岛细胞超微结构观察动物颈动脉放血处死,取胰腺,置于 4,2.5%戊二醛固定液(0.2mol/L 磷酸缓冲液配制)中,常规透射电镜样品制备,醋酸铀和硝酸铅双重染色,Et 立H.600 透射电镜观察并照相.2 结果2.1No.1886 对血浆葡萄糖的影响图 1 表示 3 组空腹血糖的变化曲线,前 3 个月饲喂高脂高糖饲料后,HFSD 组和 No 一 1886 组(此时尚未加 No 一 1886)的空腹血糖 3 个月末时分别为(12124)mg/dl 和(13131)mg/dl,与正常对照组(5110)mg/dl 比较呈显着
18、升高(P0.05).从第 4 个月初开始用 No 一 1886 治疗后,HFSD+No 一 1886 组的空腹血糖逐渐下降,在实验期第 5 个月(加药后 2 个月)时接近正常水平,和 HFSD 组比较差异具有显着性意义(P0.05).这显示 No 一 1886 抑制了小型猪的空腹血糖水平.0昙奄(“与 CD 组比较 P0.001,与 CD 组比较 P0.05,不同时间比较 P(005)图 1No-1886 对小型猪空腹血浆葡萄糖的影响(s)(comparedwithCDgroup“P0.001.P0.05.ComparedwithdifferenttimeP0.05)Fig.1Effectof
19、No 一 1886treatmentonfastingplasmaglueose(s)2.2No.1886 对血浆 TG 的影响如图 2 所示,HFSD 组血浆 TG 水平持续升高,在 3 个月末时达(15921)rag/dl,最高时(6 个月末)达(186 27)mg/dl.而 CD 组 TG 水平(3 个月末时为5711mg/d1),未见明显升高,两组比较差异具有显着性意义(P0.05).在 HFSD+No 一 1886 组,加药前 TG 水平持续升高,3 个月末时为(16224)mg/d1.与 HFSD 组相当,而在加药后 TG 水平持续下降,于第 4 个月(加药后 1 个月) 时,与
20、HFSD 组比较差异具有显着性意义(P0.05).这显示 No 一 1886 抑制了小型猪 TG 水平.量罾吾震 2蠡差鲁(与 CD 组比较 P0.05,不同时间比较 P0.05)图 2No 一 1886 对小型猪空腹血浆甘油三酯的影响 (;)fComparedwithCDgroupP0.05.ComparedwithdifferenttimeP005)Fig.2EffectofNo 一 1886treatmentonfastingplasmatriglyceride(;s)2.3No.1886 对空腹血血清胰岛素的影响图 3 表示 3 组动物空腹血清胰岛素水平变化曲线,HFSD 组胰岛素水平
21、持续升高,到第 4 个月时达到最高(22.5 1.6)mU/ml,之后胰岛素水平下降,到8 个月时为(16.41.2)mU/ml,而在 HFSD+No1886组加药后,胰岛素水平逐渐下降,到加药后 1 个月末时接近正常水平.结果表明 No 一 1886 有减轻胰岛素抵抗的作用.鞭亏曰(与 cD 组比较 P0.05,不同时间比较 P0.05)图 3No 一 1886 对小型猪空腹血清胰岛素的影响(;s)(ComparedwithCDgroupP0.05.ComparedwithdifferenttimeP0.05)Fig.3EffectofNo 一 1886treatmentonfastings
22、eruminsulin(;s)2.4No-1886 对胰腺组织结构的影响(见图 4,封三)HFSD 组(图 4b)胰腺组织表现为胰岛肥大,数量减少,胰岛内细胞数目亦减少,胰岛细胞空泡变性,核呈梭形或不规则形,细胞外基质增多,在胰岛周围少量淋巴细胞浸润.HFSD+No 一 1886 组胰岛与加加 O一一日暮一0 一I00 一106 中国实验动物 2004 年 6 月第 12 卷第 2 期ActaLabAnitaSeiSin,June,2004,Vo1.12.No2腺体结合紧密,胰岛细胞较多,核圆或椭圆,胰腺组织结构基本正常(图 4c).2.5No.1886 对胰岛细胞胰岛素分泌功能的影响图 5(
23、见封三 )是用猪胰岛素抗体染色的胰腺组织显微照片.HFSD 组胰岛着色区域较少(图 5B),而 HFSD+No 一 1886 组胰岛着色区域较多( 图 5C),CD组胰岛着色区域最多.以 l3 细胞(着色区域)占胰岛面积的百分比比较,HFSD 组比 HFSD+No 一 1886 组少(19.43.2)%,比 CD 组少(24.7 4.3)%.结果(图 6)提示,No 一 1886 治疗后 ,明显改善了胰岛 G 细胞分泌胰岛素的功能.2.6No.1886 对胰岛 p 细胞超微结构的影响HFSD 组胰岛 l3 细胞肿胀,细胞内颗粒溶解或脱落,细胞呈空泡样变,局部结构较模糊,部分呈纤维化,可见大量脂
24、滴堆积(图 7C).HFSD+No 一 1886 组(图 7B)胰岛 8 细胞结构明显比 HFSD 组好.细胞内3 讨论颗粒丰富,结构较清晰,未见明显脂滴,和 CD 组细胞结构相近(图 7A).说明 No 一 1886 对细胞结构有恢复作用.图 63 组小型猪胰岛中胰岛素结果分析Fig.6Analysisofimmunostainingforinsulininisletof3groupsminipigs(A.CD 组;B.HFSD+No.1886 组;C.HFSD 组)图 73 组小型猪胰岛中胰岛 B 细胞超微结构照片(8000)(A.CDgroup,BHFSD+No-1886group.C.HFSDgroup)Fig.7Electronmicrographof 口 cellofisletsof3groupsminipigs(8000)2 型糖尿病发生的主要病理生理特征是:胰岛素对外周组织代谢调节作用受到拮抗而减弱(即胰岛素抵抗)和随着血糖,血脂的升高而出现的胰腺 8
