1、肺炎衣原体抗体酶免疫诊断试剂盒的研制及应用现代检验医学杂志 2006 年 7 月第 21 卷第 4 期JModLabMed,July2006,Vol?21,No?451肺炎衣原体抗体酶免疫诊断试剂盒的研制及应用薛晓英,何素华,陈锡枚,刘士德.(1.深圳市博卡生物技术有限公司,广东深圳 518049;2.深圳大学生命科学院,广东深圳 518000)摘要:目的建立酶免(问接)法检测人血清中肺炎衣原体抗体.方法用 HEP 一 2 细胞培养肺炎衣原体 AR 一 39 株,获得肺炎衣原体抗原后,利用该抗原与人血清中特异性抗体发生反应及辣根过氧化物酶标记的抗抗体催化 TMB 显色来指示人血清中抗肺炎衣原体
2、抗体的存在.结果抗原稀释度 1g/ml,血清稀释度为 1:50,目测效果较好.门诊随机血清阳性检出率高达 8.78,此法特异性 94.7O,灵敏度 90.50,试剂盒批内差 CV=8.87,批间差CV=6.92.结论该方法简便快捷.特异性,灵敏度,准确度较好,可以在医院大力推广.关健词:肺炎衣原体;酶免疫法;抗原;抗体中图分类号:R3743R446.1 文献标识码:A 文章编号:1671-7414(2006)0405102肺炎衣原体(CP)是衣原体分支的一种,具有衣原体的特性.机体感染衣原体后,产生非特异性免疫,并诱导产生型特异性细胞免疫和体液免疫,但获得性免疫不强,为时短暂,因此衣原体感染是
3、持续感染,反复感染或隐性感染.在各种微生物所致的肺炎中,肺炎衣原体占 1O12,肺炎衣原体感染与早期无症状的颈动脉粥样硬化及其它心血管疾病密切相关.对肺炎衣原体的检查与治疗已得到医学界的空前关注.1 材料和方法1.1 材料1.1.1 试剂:HEP 一 2 细胞,肺炎衣原体 AR 一 39 株,硫酸铵,DMEM 培养基,甘油,NaN.等.1.1.2 仪器:CO.培养箱,高速冷冻离心机,超声波细胞粉碎机,透析袋,752 紫外分光光度计,一 8O冷冻冰箱等.1.2 方法1.2.1 抗原制备方法1.2.1.1 肺炎衣原体的培养:将 HEP 一 2 细胞培养成融合单层,加入肺炎衣原体 AR 一 39 株
4、(购自美国ATCC 公司),25水平离心 1300r/min1h,弃上清,于 375(v/v)CO.培养箱 1h,弃上清,按等量加入 DMEM 培养基及放线菌酮,再置于 375(v/v)CO.培养箱培养 72h,取出培养瓶置于一 2O及室温反复冻融多次,再 1000r/min 离心 5min,取上清即含肺炎衣原体.一 7O保存.1.2.1.2 肺炎衣原体的纯化:肺炎衣原体经 33g/dl 饱和硫酸铵和 50g/dl 饱和硫酸铵分级沉淀,562h 灭活后进行超声破碎,4离心 12000r/min30min,取上清加 50g/dl(v/v)甘油(ASA),静置 2h 以上使其成为沉淀物,41200
5、0r/min离心 15min,弃上清,将沉淀物溶于 PBS 中,用饱和硫酸铵提取,方法同前.1.2.1.3 透析:将提取好的肺炎衣原体抗原装入透析袋,透析三次后 752 紫外分光光度计测定抗原蛋白含量.1.2.1.4 抗原保存:加入 0.1g/dlNaNa 和等体积的甘油,-80 保存备用.1.2.2 试剂盒制备方法1.2.2.1 肺炎衣原体酶免疫检测方法原理:用已知的肺炎衣原体抗原包被酶标板检测人血清中的抗肺炎衣原体特异性抗体,辣根过氧化物酶标记抗抗体,催化 TMB 发生显色反应,根据颜色深浅判断标本中肺炎衣原体抗体的量.1.2.2.2 包被浓度及血清稀释度确定:采用棋盘滴定法原理,检测的最
6、佳抗原包被浓度为 1ug/ml,血清稀释度为 1:50.1.2.2.3 抗体检测:用肺炎衣原体纯化抗原包被96 孔板,100ul/孔,4过夜;用含 1O15(v/v)小牛血清的 PBS 封闭 300ul/孔,4过夜;加入已稀释的待检血清,37孵育半小时,洗板 3 次后加入辣根过氧化物酶标记的抗人 IgG 孵育半小时,洗板同前加入底物 TMB 显色 10min,加终止液终止,450630nm 测定其吸光度 A 值,阳性反应判断标准:P/N 2.1 为阳性.2 结果2.1 方法学考核2.1.1 特异性试验:1O 份阳性血清,1:50 稀释后与同体积抗原混合,37中和 2h 后,与未中和标本进行抗体
7、对照检测,中和率 25.692.3,特异性 100.2.1.2 可靠性实验:不同批次检测同一样品,每次每份 12 孔,结果为:组 1 样品批间 CV=6.8O,组2 样品批间 CV 一 10.10,组 3 样品批间 CV 一3.86,平均批间 CV 一 6.92;第 1d 实验批内CV 一 10.90,第 2d 实验批内 CV 一 6.42,第 3d 实验批内 CV=9.28,平均批内 CV=8.87.2.1.3 稳定性实验:将试剂盒分 4 组,分别置 4,371d,37.C2d,373d 后同时检测.组1 批间 CV 一 8.70,组 2 批问 CV 一 5.05,组 352 现代检验医学杂
8、志 2006 年 7 月第 2l 卷第 4 期JModLabMed,July2006,Vo1.21,No.4批问 CV=8.020A,平均批间 CV=7.26.2.1.4 灵敏度与线性实验:取两份阳性血清每份做 1:50,1:i00,1:200,1:400,1:800 稀释后测值,结果如表 1.表 1CPIgG 检测灵敏度与线性实验2.1.5IgG 标准浓度与值关系:测 CPIgG1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml,1/g/ml,10/g/ml标准品浓度.CPIgG 含量 1ng/ml 时其 A 一0.220,故确定to.210+ 空白孔值为阳性(空白孔值不足 0.i00 时以 0
9、.i00 计算).该试剂盒CPIgG 阳性最低检测浓度为 1ng/ml.2.1.6 对照实验:该试剂盒与美国 GenBio 公司ImmunoWELL(金标准)试剂盒做对照比较 .同时检测 8O 份随机样品(包括阴性和阳性样品),结果如表 2:表 2 自产试剂盒与金标准对照实验依据检测结果计算:灵敏度 9O.5O,特异性94.7O,假阳性率 9.50,假阴性率 5.20,粗一致性 92.5O,调整后一致性 92.45,约登指数85.209,6,阳性预示值 92.509,6,阴性预示值9O.OO.2.2 检测结果门诊随机血清 444 例,其中 39 例呈 IgG 阳性,检出阳性率为 8.78.3
10、讨论3.1 肺炎衣原体经飞沫或呼吸道分泌物传播,有散发和流行交替出现的特点,潜伏期平均为 30d左右,在感染人群中流行可持续 6mo 左右.肺炎衣原体已被列为对中国人卫生健康有重大影响的十二种病原微生物之一,是近年新认识的呼吸系统重要的常见病原菌.据资料表明其不但引起急慢性呼吸道感染,还与多种疾病有关,如:心血管疾病,中耳炎,关节炎等.人血清抗 CP 抗体阳性率儿童1O2O,成人 4O6O,老年人可达 8O.血清 IgM,IgG 可鉴别急性感染或既往感染,IgM于发病后 3w 出现,IgG 于 68w 出现;若重复感染或再次感染,则 IgG 常在 12w 内出现,且效价高(强阳性 ),往往没有
11、 IgM 出现.因此,高滴度IgG 抗体在近期 CP 感染血清学诊断方面与 IgM抗体同等重要,在高效价 IgG 患者中 IgM 通常缺如.3.2 自制试剂盒与金标准试剂盒检测结果存在差异的原因主要是:抗原来源不同;试剂盒反应体系不同,如:包被板的抗原浓度,样品稀释比例,酶标记的抗抗体,操作程序,孵育温度,测值波长等不同;自建反应体系液体配置与金标准不同等,造成两种试剂盒的粗一致性 92.5O,调整后一致性 92.45.但自制试剂盒检测标本时反应模式较金标准好,阴阳结果分明.3.3 肺炎衣原体呈梨形,直径 0.20.4p.m,普通光学显微镜下勉强可见,对热敏感,在 5660能存活 51Orai
12、n,一 7O可保存几年.利用 PCRD 检测及涂片一直接酶免法,直接荧光法可检测肺炎衣原体的存在,微量免疫荧光实验也可检测血清中抗体的存在.这几种方法中由于 PCR 高度敏感,容易发生交叉污染而造成假阳性.而涂片一直接酶免法,直接荧光法,微量免疫荧光实验比较繁琐,需要检测者具备丰富经验,设备昂贵,不能同时检测大量标本.衣原体培养检测受肺炎衣原体本身特性的影响,阳性检出率极低.而间接酶免法检测肺炎衣原体抗体,操作简便快捷,灵敏度达 9O.5O,特异性 94.7O,适于检测大量标本,结果判断的客观性强,适合于中小型医院使用.参考文献:1傅继华.病毒学实用实验技术M.济南:山东科学技术出版社,200
13、1.2陆德源.医学微生物学 EM.北京:人民卫生出版社,1996,4;183184.33 武建国 ,顾可梁,童明庆,等.医学实验诊断学进展EM.南京 :东南大学出版社,2000,5:4247.43 朱立平 ,陈学清.免疫学常用实验方法M.北京:人民军医出版社,2000,3:342352.E5BrucoL,WilkoffandPatrickJTchou.AnewapproachtobiophasicwaveformsforexternaldefibrillationJ.Circulation,1999,100:826831.63HughSMarkus,MatthiasSitzer,DavidCarrington,eta1.ChlamydinpneumoniacinfectionandearlyasymptomaticcarotidatherosclerosisJ.Circulation.1999.】OO:832837.收稿日期:20060223
