1、肝细胞癌端粒酶活性及 hTERT mRNA 表达与术后早期复发的关系?48?肿瘤 2006 年 1 月第 26 卷第 1 期 TumorVo1.26.No.1,Jan.2006ClinicalResearch?临床研究肝细胞癌端粒酶活性及 hTERTmRNA 表达与术后早期复发的关系范瑞芳,卫立辛,沈锋,王维峰,贾凤岐,卜欣欣,郭献灵,吴孟超(第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤免疫和基因治疗中心,上海 200438)摘要目的:研究肝细胞癌端粒酶活性及人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA 表达与肝细胞癌术后早期复发的关系.方法:采用 ElISATRAP 法检测 6O 例肝癌组织及其癌旁组织端粒酶
2、活性,RTPCR 法检测 hTERTmRNA 表达,5 例正常肝脏组织作为对照.分析端粒酶活性及 hTERTmRNA 表达与临床病理之间的关系.结果:肝癌组织端粒酶活性及 hTERTmRNA 表达阳性率分别为 86.7(52/60)及 9O(54/60),癌旁组织端粒酶活性及hTERTmRNA 表达阳性率分别为 4O(24/60)及 43.3(26/60).正常肝脏组织均未检测到端粒酶活性及 hTERTmRNA 表达.癌旁组织端粒酶活性及 hTERTmRNA 表达与术后早期复发及包膜浸润,门静脉侵犯 ,肝内转移等恶性肿瘤的恶性生物学行为有关.结论:癌旁组织端粒酶活性及 hTERTmRNA 表达
3、可能是肝细胞癌术后早期复发的预后指标.关键词 肝肿瘤 ;癌,肝细胞 ;端粒酶;人端粒酶逆转录酶 ;肿瘤复发中图分类号R735.7文献标识码A 文章编号10007431(2006)01004804CorrelationofpostoperativeearlyrecurrencewithbothtelomeraseactivityandhumantelomerasereversetranscriptasemRNAexpressioninhepatocellularcarcinomaFANRuiFang,WEILiXin,SHENFeng,WANGWeiFeng,JlAFengQi,BUXinXin
4、,GUOXianLin.WUMengChao(TumorImmunologyandGeneTherapyCenter,EasternHepatobiliarySurgeryHospital.SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200438,China)ABSTRACT0b.iective:Tostudythecorrelationofpostoperativeearlyrecurrencewithbothtelomeraseactivitvandhumantelomerasereversetranscriptase(hTERT)mRNAexpress
5、ioninhepatocellularcarcinoma(HCC).Methods:TelomeraseactivitvwasdetectedbyEl1SAbasedtelomerierepeatamplificationprotocol(ELISATRAP)in60HCCtissuesandadjacentnon-tumorlivertissuesatadistanceof2cmfromHCCnodules.ExpressionofhTERTmRNAwasmeasuredbyreversetranscriPtionalDolymerasechainreaction(RTPCR).Fiveno
6、rmallivertissueswereusedascontro1.ThecorrelationofclinicopathologicalfeatureswithbothtelomeraseactivityandhTERTmRNAexpressionwasanalyzedstatistically.Results:ThepositiveratesoftelomeraseactivityandhTERTmRNAexpressionwere86.7(52/60)and90(54/60),respectively,inHCCtissues,and40(24/60)and43.3(26/60),res
7、pectively,inadjacentnon-tumorlivertissues.NeithertelomeraseactivitynorhTERTmRNAex-pressionwasdetectedin5normallivertissues.TelomeraseactivityandhTERTmRNAexpressioninadjacentnon-tumorlivertissueswerecloselyassociatedwiththepostoperativeearlyrecurrenceandthebiologicallymalignantbehaviorsofthetumoritse
8、Ifsuchasinfiltrationofinflammatorycellsaroundfibrouscapsule,portalvenousinvasion,andintrahepaticmetastasis.C0ncJusions:TelomeraseactivityandhTERTmRNAexpressioninadjacentnontumorlivertissuesofHCCmayserveasusefuIDredictorsofpostoperativeearlyrecurrence.1YWORDSLiverneoplasms;Carcinoma,hepatocellular;Te
9、lomera:肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤,其总体疗效不理想.早期复发是影响术后生存率的主要因素,因此预测 HCC术后早期复发对于提高术后生存率具有重要意义.随着肿瘤分子生物学研究的不断深入,已发现了一基金项目1.国家自然科学基金项目(编号:30471994)2.国家“九七三 “项目(编号 :G2000057001)3.上海市科委基础研究重大项目(编号:04DZ14006)4.上海市科委浦江人才计划项目(编号:05PJ1410)作者简介 范瑞芳 (1965),男 (汉族),硕士.副主任医师,现在兰州军区总医院肝胆外科工作Correspo
10、ndingauthor.Tel:02125070855E-mail:weilixinyahoo.cornHumantelomerasereversetranscriptase;NeoplasmrecurrenceTumor,2006,26(1):4851些可能与预后相关的分子标志物,但迄今仍然没有找到可靠,敏感的预后指标.端粒酶是近年来肿瘤学研究的一个热点,在肿瘤的发生中可能具有重要的作用,8O9O 肝癌组织表达端粒酶活性.人端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶的催化亚基,在端粒酶的激活中具有重要的作用.所以端粒酶活性及 hTERTmRNA 表达能否作为肝癌术后早期复发的预测指标值得进一步研究
11、.1 材料与方法1.1 材料所有样本均取自东方肝胆外科医院 2001年 9 月2002 年 9 月间手术切除的原发性肝癌标本,第 1 期.范瑞芳,等.肝细胞癌端粒酶活性及 hTERTmRNA 表达与术后早期复发的关系?49?共 6O 例,病理证实为 HCC.男 42 例,女 18 例,平均年龄(47.4 10.8)岁.其中 HBsAg 阳性 40 例,AntiHCV 阳性 6 例,HBsAg 合并 AntiHCV 阳性 4 例.Child 分级,A 级 44 例,B 级 16 例.血清 AFP 滴度水平(532.5-4_378.9)g/L.肿瘤最大直径 (54.227.5)mm.肿瘤组织学分化
12、程度,高分化 16 例,中分化 18 例,低分化 26 例.TNM 分期:期 36 例,A期 14 例,B 期 5 例,A 期 5 例.包膜浸润 20 例,门静脉侵犯 9 例,肝内转移 11 例,1 年内复发 22 例.所有样本均在手术室取样后立即置于液氮中,保存于一80C,分别切取肿瘤组织及距肿瘤边缘 2cm 处癌旁组织,肝癌组织应避免取到坏死部份.1.2 主要试剂 ELlSATRAP 端粒酶检测试剂盒购于 Intergen 公司.RNAexreagent 购于上海华舜公司.Oligod(T),TaqDNA 多聚酶购于上海生工公司.MMLV 逆转录酶,rRNasinRibonucleaseI
13、nhibitor 购于 Promega 公司.hTERT-F 引物,hTERTR 引物,GAPDHF 引物及 GAPDHR 引物均由上海生工公司合成.1.3ELISATRAP 检测端粒酶活性CHAPS裂解缓冲液制备肝脏组织提取液,一 80.C 冻存,Bradford 法测定蛋白浓度;采用端粒重复序列扩增法(TRAP)获得扩增产物,PCR 条件:9430S,5530S,33 个循环 ;采用 ELlSATRAP 端粒酶检测试剂盒行端粒酶活性检测,酶联免疫检测仪测定波长 450nm 及 690nm 光密度值,记录样本光密度值 D 一 D 一 D.;人胚肾 293 细胞作阳性对照,CHAPS 裂解缓冲
14、液替代组织提取液作阴性对照,85C10min 灭活组织提取液端粒酶活性作另一阴性对照(光密度值为 D),含有 8 个端粒重复序列(TTAGGG)的模板 TSR8 作 PCR 及ELISA 正确性对照;检测结果以 2xD 表示,ADD 一 D.所有对照组检测结果正确时,AD0.150 为端粒酶弱阳性,AD1.000 为端粒酶强阳性,每份样本至少检测 2 次.1.4RTPCR 检测 hTERTmRNA 表达RNAexreagent 裂解液提取肝脏组织总 RNA,测定Ds.值,一 80C 保存; MMIV 逆转录酶行逆转录反应(RT),RT 产物(cDNA) 2O:C 保存或进行PCR 反应;PCR
15、 及琼脂糖凝胶电泳.PCR 引物为 hTERTF(5 一 CCTCAGGCGACAAGGAGCAG 一3)及 hTERTR(5一 AGCGGGCAGTGCGTCTTGAG 一 3).PCR 条件:94C30S,65IC30S,72C55S,3O 个循环或 45 个循环,最后 72:C 延伸 5min.扩增产物经 1 琼脂糖凝胶电泳后紫外成像;人胚肾 293 细胞作阳性对照,正常成人成纤维细胞作阴性对照,GAPDH 扩增条件,F:5r_ACCACAGTC CATGCCATCAC 一 3,R:5 一 TCCACCACCCTGTTGCTGTA 一 39430S,6O.C30S,7245S,30个循环
16、,最后 72延伸 2min.根据 Toshikuni 等提出的半定量 RT-PCR 方法,样本 30 个 PCR 循环后出现阳性条带定义为强阳性(+),45 个 PCR 循环后才出现阳性条带定义为弱阳性(+),45 个 PCR循环后仍没有出现阳性条带定义为阴性(一).1.5 统计学分析数据资料采用第二军医大学卫生统计教研室 SAS6.12 软件进行分析.均数比较采用 t 检验,率的比较采用.检验,小样本率的比较采用 Fisher 精确概率法,配对资料率的比较采用McNemar 检验 ,计算 Kappa 值,单向有序资料的比较采用 CochranMantelHaenszel 法统计.2 结果2.
17、1 端粒酶活性及 hTERTrnRNA 检测结果肝癌组织及癌旁组织端粒酶活性检测结果见表 1,肝癌组织端粒酶活性表达阳性率为 86.7,癌旁组织端粒酶活性表达阳性率仅为 40.0,两者具有显着的统计学差异(P0.01).hTERTFin_RNA 检测结果见表 2,肝癌组织 hTERTmRNA 表达阳性率为 90.0,癌旁组织 hTERTmRNA 表达阳性率仅为 43.3,两者亦具有显着的统计学差异(P0.01).实验结果表明,肝癌组织端粒酶活性及hTERTmRNA 表达阳性率明显高于癌旁组织,而正常肝脏组织未检测到端粒酶活性及 hTERTmRNA 表达.RTPCT 检测结果见图 1.同时研究表
18、明,肝癌组织及癌旁组织中端粒酶活性与hTERTmRNA 表达水平间具有显着相关性(Kappa 一 0.9268).表 1 端粒酶活性检测结果Table1DetectionoftelomeraseactivitybyTRAPassay表 2hTERTmRNA 检测结果Table2DetectionofhTERTmRNAexpressionbyRT-PCRassay图 lRT-I,CR 法检测肝癌蛆织及其癌旁组织 hlERItuRNA 结果FiE.】 Detectionf.FhTERltuRNAexpressionbyRlllRiFI 儿【tIuesandnonlumotIisuM1r,TIIr-
19、.cIII.|I:,i;P:Illii. .lllil_?l.1inl 【TIiIv-kiI1iilLJJ.1LIrIl_-N,l:c【iii【Il-rIilrc1,i:!,.iTiltIiii.,x1.n,lliI“I! -iIlIIiII(iii.iIllli1iiIll-rI,L.11II,ItIml,l,I1|l-一 l1ilI-Hhi,I.,.1】R1IiRNlI 【 rii1lIHLri,ii.I.iLI,-iiiij.lIl【一 1:lri,Ili!iillJI,2卷!.2 端粒酶活性及 h7ER-I,mRA 表达与临床病理的关系肝痈组织段癌旁 l 织的端牡酶活性盐hTEITmI
20、tNA 表达与部分临床犄理参数的关系表肝癌组织端粒脯活性_J 立 hrER,mR_A 表达与年龄,肿瘤人小段 AFP 水平的 j系见表 1 癌旁绳织端粒酶活及 hIER1nIRNA 表达与年龄,肿瘤太小及 AFP 水平的关系表 5=统计学分析结果表口.肝癌组织端粘酶活性技】TERFmRNA 表达与所有临床病理参数均无显普 j:=I 关(Pl1.一?5J:癌旁组织端粒酶活性及 b-lER_rn】RNA 表选与午龄,墒大小,惺肝炎,肝硬化肝功能LhiId 行级,血清 AFI 滴度水 l 硬肿瘤绀织学分化度均尤显菩丰 I=】荚 H:( 】 一).但了术后 1 年 l复绽,包膜谰,门静脉侵把 J 盘肝
21、转移均显菩相关性 lPn.I:j)表 3 肝癌组织及癌旁组织端粒酶活性及 h1HR1mRNA 表达与临床病理的关系)Iabl3(?1】 parismrleh?兀1PraeacliitytnelhI_ERJtuRNAen|【InWilheliniclpathI,IoldcftflllrCsinll【(tisslKand?I 盯一“lmlrtissutcJ】-0r十 PclIT-,lIILh:JI1lIh1】vTfIrr!,lslAIllIliL,ll_l_】.iIilf Oli,rI_lllLl,1I.III.EI(一IIfhnill1.1_【W1.Ii,Tl-IiIIrilfIir-?】1li
22、PTliLI_lAl,L1.Il,rtH1nll1l_P 一1llHAhrl【 lPr0IL“IlrRllriw_ll-lnlliLc.rIrt!iIt0IS.-AIml,ll【iI4?:,Ejn.I:II簟第 1 期.范瑞芳,等.肝细胞癌端粒酶活性及 hTERTmRNA 表达与术后早期复发的关系表 4 肝癌组织端粒酶活性及 hTERTmRNA 表达与年龄,肿瘤大小及血清 AFP 水平的关系3 讨论肝癌术后复发率非常高,即使是直径小于 5cm的肝癌,手术切除或施行肝移植后 5 年复发率仍超过 5O%5.所以预测肝癌术后早期复发对肝癌的治疗可能起到一些积极的作用.血清 AFP 及超声检测是目前肝
23、癌术后复发转移最为常用和有效的监测手段,但我国仍有 3O4O 肝癌患者血清 AFP阴性,超声检查也存在不能发现隐蔽的微小复发转移灶的问题.发现适用于临床的高度敏感和可靠的生物学预后指标对预测肝癌术后复发具有重要意义.端粒酶活性在绝大部分永生化细胞,恶性肿瘤细胞及生殖细胞中表达阳性,而正常细胞不表达端粒酶活性.hTERT 被认为是端粒酶的主要亚基,具有催化活性作用,端粒酶的活性主要由 hTERT决定的 I6.因此,端粒酶活性及 hTERT 表达与术后早期复发等临床病理因素关系值得探讨.本研究结果表明.肝癌组织端粒酶活性及hTERTmRNA 表达与所有临床病理因素无关.而癌旁组织端粒酶活性及 hT
24、ERTmRNA 表达与病人的年龄,肿瘤直径,是否伴有肝炎及肝硬化,肝功能 Child 分级,血清 AFP 滴度水平及肿瘤分化程度等因素无显着相关性,但与术后 1 年内早期复发及包膜浸润,门静脉侵犯,肝内转移等恶性潜力呈显着相关性.分析其原因,可能与残留的癌旁组织中存在微血管转移灶或微卫星病灶有关.Youssef 等采用原位-TRAP 法对癌旁组织端粒酶活性进行研究后认为,癌旁组织端粒酶活性的表达可能与微小转移灶或局部浸润有关.端粒重复序列扩增法(TRAP)能够检测到 1O 个人胚肾 293 细胞的端粒酶活性,具有很高的敏感性,常规病理学检查不能发现的肿瘤细胞可能经端粒酶活性检测能够发现 l8.
25、所以,癌旁组织端粒酶活性或 hTERTmRNA 表达水平的检测可能是预测肝癌术后早期复发及肿瘤恶性潜力的一个有用的生物学指标.但有必要对癌旁 2cm 以上组织同时进行病理学及端粒酶活性的对照研究,以进一步证明癌旁组织中微小病灶存在的可能性.参考文献1Q1NlJx,TANGZY.TheprognosticmolecularmarkersinhepatocellularcarcinomaJ.WorldJGastroentero1.2002,8(3):385392.E2MASUT()MIK,HAHNWC.TelomeraseandtumorigenesisJ.wrLen,2003,194(2):16
26、3172.33JANKNECHTR.Ontheroadtoimmortality:hTERTupregulationincancercellsJ.FEBSLett,2004.564(1-2):913.4TOSHIKUNIN,NOUSOK,HIGASHIT,eta1.Expressionoftelomerase-associatedprotein1andtelomerasereversetran-scriptaseinhepatocellularcarcinomaJ.Jer,2000,82(4)833-837.51AOVETJM,BEAUGRANDM.Hepat0ceIlularcarcinoma:presentstatusandfutureprospectsJ.JHepato1.2003,38(Suppl1):36149.
