1、肝纤维化的动物模型及治疗药物研究中国药理学通报 CkinesePharma(JlogicalBulletin2004May;20(5):4815?481?讲座与综述肝纤维化的动物模型及治疗药物研究吴丽魏伟(安徽医科大学临床药理研究所,合肥 230032)中国图书分类号 R363332;R575.2;R575.205文献标识码 A 文章编号 10011978(2004)0504810j摘要肝纤维化是肝损伤后的修复反应,涉及复杂的细胞及分子机制.选择与人类相似的肝纤维化动物模型不仅是深入研究肝纤维化发病机制的重要基础,也是筛选防治肝纤维化药物的有效手段.随着人们对肝纤维化的认识不断深入.有效的防治
2、肝纤维化已成为可能.该文就肝纤维化的动物模型及抗纤维化的药物研究作一综述.关键词动物模型;药物治疗;肝纤维化肝纤维化是肝损伤持续存在,组织发生修复反应时因细胞外基质合成,降解与沉积不平衡而引起的病理过程,是慢性肝病重要的病理特征,也是进一步向肝硬化发展的主要中心环节.肝脏内细胞一细胞,细胞一基质,基质一介质问的相互作用,构成了复杂的网络系统,参与肝纤维化的发生及发展.在西方国家,酒精性肝损伤是造成肝纤维化的主要原因,而在东南亚和我国则以肝炎病毒尤其乙型肝炎病毒的持续感染引起为主 u.选择与各种原因所致人类慢性肝病相似的肝纤维化动物模型不仅是深入研究肝纤维化发病机制的重要基础,也是临床筛选防治肝
3、纤维化药物的有效手段.近年来,随着医学分子生物技术的迅速发展和应用,人们对肝纤维化的认识不断深入,推动了对肝纤维化防治的深入探讨.本文就肝纤维化的动物模型及抗纤维化的药物研究作一综述.l 肝纤维化的动物模型为了深入研究肝纤维化的病因与发病机制,病理生理过程及病理形态改变,筛选防治肝纤维化的有效药物,国内外学者进行了大量的动物实验.并建立了一些比较成熟的动物病理模型.目前应用比较200311 一 O3 收稿,20031219 修回国家“863“项目,No2002AA2Z3235;安徽省人才开发基金资助No2001Z023作者简介:吴丽,女,27 岁.硕士研究生;魏伟.男.43 岁.博士.教授.博
4、士生导师.通讯作者Tel:0551.5161208.Email:广泛的整体动物模型有化学性肝纤维化,免疫性肝纤维化,酒精性肝纤维化,胆总管结扎致肝纤维化,营养性肝纤维化,血吸虫性肝纤维化等.每种方法致病因素不同,纤维化产生机制,稳定性,重复性及与人患病过程相似程度等都不尽相同.1.1 化学性肝纤维化1.1.1 四氯化碳(CC14)致大鼠肝纤维化 CC14 是氯化烷烃类化合物,可直接溶解肝细胞膜,同时,CO1 经肝细胞细胞色素.依赖性混合功能氧化酶的代谢,生成活泼的三氯甲基自由基和氯甲基自由基,启动脂质过氧化作用,致肝细胞损伤.该模型在实验早期即可见明显的肝细胞损伤和炎症反应,在实验第 69wk
5、 时即可见明显的纤维组织增生.CC1 诱导的肝纤维化动物模型在形态学,病理生理学的某些方面与人肝纤维化相似,如二者有肝细胞坏死后的再生;实验动物表现的体征及肝功能异常与人慢性肝病进展为肝硬化时相似;造模途径多样,简便,病理特征稳定可靠,造模时间短,已广泛用于研究肝纤维化发生的细胞及分子机制,血清学标志物与组织病理的相关性及抗纤维化物质的药效评价.1.1.2 二甲基亚硝胺(DMN)致大鼠肝纤雏化DMN 具有肝毒性,基因毒性和免疫毒性,其活性代谢产物使核酸,蛋白质等重要的生命物质发生甲基化反应,随后导致肝细胞坏死,细胞外基质进行性增加.与 CC1 造模相比 ,该模型中肝细胞无脂肪变性,肝纤维化形成
6、相对稳定.值得注意的是,DMN所致肝内出血性病变与 CC1 所致肝内凝固性病变不同,其肝损伤比较严重.因此在评价药物对伴有凝血障碍,纤溶亢进的慢性肝病致纤维化的防治效果时,采用 DMN 肝纤维化模型较为合适.另外该模型还用于研究不同细胞外基质的产生部位,评价肝纤维化血清标志物的可靠性等.1.2 免疫性肝纤维化慢性肝病迁延不愈的本质与免疫反应有关.用猪血清或人血清白蛋白作为抗原,反复注射实验动物,在肝脏门脉汇管区有免疫复合物沉积,引起血管炎和血管周围炎,形成广泛的慢性炎症病变,激发肝内静止的肝星状细胞(hepatic482.中国药理学通报 Chi“Pharmaco.gif 口 B“2004May
7、;20(5)stellatecell,HSC,即贮脂细胞 )向肌成纤维细胞转化.分泌胶原,致纤维化.免疫性肝纤维化与化学性肝纤维化相比,前者的分子机制与人肝纤维化有一定相似性,细胞外基质以,型胶原蛋白沉积为主,血清及肝组织局部TGFp 含量较少,窦状隙毛细血管化较明显:.且纤维化形成较稳定,对动物整体损伤轻微,在研究肝纤维化,肝硬化的产生机制,早期诊断及评价药物疗效,筛选通过免疫机制而抗肝损伤药物方面,较化学性肝纤维化模型有其不同的特点与优点.另外,该模型还一直用于研究吞噬细胞,Ito 细胞及肌成纤维细胞在肝纤维化中的作用及肝纤维化过程中肝内微循环的改变 j.1.3 酒精性肝纤维化肝是乙醇代谢
8、的主要场所,在其代谢过程中,肝细胞 NADH,/NAD+比率改变和脂肪积蓄及脂质过氧化均可对肝细胞造成损伤,导致肝细胞脂肪变性,坏死一其中脂质过氧化可能不仅为始动因素,而且是肝纤维化的决定性因素.该模型主要用于酒精性肝病的研究.1.4 营养性肝纤维化给大鼠高脂一低蛋白饮食,在实验 1224wk 可形成典型的肝硬化.该模型与人的酒精性肝病相似,较适用于人类酒精中毒性肝纤维化的研究.1.5 胆总管结扎致肝纤维化采用胆总管结扎的方法,可在狗,大鼠,猴等动物中制作出实验性胆汁性肝纤维化,肝硬化模型,在无炎症及坏死的情况下发生进行性肝纤维化,与人类小结节性肝硬化的生化及组织学变化相似,且纤维化形成较快,
9、自发逆转率低,被认为是一种能模拟人肝纤维化的较理想动物模型,主要用于考察药物的直接抗纤维化作用及用于筛选非创伤性肝纤维化血清指标等的研究.1.6 血吸虫性肝纤维化用血吸虫尾蚴来制备肝纤维化动物模型,实验第 6 周可见肝脏中心静脉的变形坏死,门脉区网状蛋白聚集并伸入到肝小叶,并最终形成肝纤维化.此种模型可用于血吸虫的药物治疗研究.理想的纤维化动物模型应与人类疾病特征相似,且造模方法简单,模型形成率高,重现性好.迄今为止,模型制作尚未完全取得成功,究其原因,与肝纤维化的病因多样性,动物和人的种属差异等有关.在现今常用的动物模型中,CC1 等化学性肝纤维化模型对不同动物致纤维化的程度差异较大,且肝毒
10、作用剧烈,动物死亡率高.免疫性肝纤维化动物模型与人肝纤维化发病机制相似,但因其没有病毒的持续复制及肝实质的持续损伤,与人肝纤维化的病理生理过程有相当大的差距.总之,理想的肝纤维化动物模型的建立是临床研究和实验研究中的一个难点,尚需进一步深入研究.2 肝纤维化的治疗目前,抗肝纤维化的药物种类较多,通过作用于肝纤维化发生的不同环节,达到抗肝纤维化目的.2.1 针对 HSC 的药物目前研究证实,在 HSC 激活过程中发生基因表达改变,包括转录激活;信号分子活化;表达细胞因子及生长因子受体,提高对这些递质的应答能力;VitA 脂滴消失,表达 a 一平滑肌肌动蛋白(alphasmoothmuscleac
11、tin,OtSMA),活化为肌成纤维细胞,细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)成分表达增多.从不同水平抑制 HSC 的激活增生已成为当前抗肝纤维化治疗研究的热点.2.1.1 干扰素-7(interferon-gamma,IFN-7)IFN 一 7 是目前研究较多的抗纤维化药物,具有广谱的抗病毒,抗肿瘤和免疫调节作用.最初认为,IFN的抗纤维化作用源于其抗病毒效应,后经多项临床研究发现,即使在无抗病毒效应的情况下,也能使乙型或丙型肝炎患者肝纤维化参数降低.IFN 一 7 与TNFa 联合应用能抑制大鼠胶原蛋白 aI(1)基因上游启动序列的转录活性,显着减少 I 型胶原 m
12、RNA,纤维连接蛋白(fibronectin,FN)mRNA 的基因表达.用 IFN 一基因治疗肝纤维化动物,发现它可显着抑制 I,型胶原的合成并抑制转化生长因子(transforminggrowthfacorbetal,TGFp1)及其型受体(TGFI3R)的表达 L8.2.1.2 维生素 A(VitA)VitA 在肝脏中以脂蛋白的形式储存在 HSC 中,它在不影响受体密度的情况下抑制血小板衍生生长因子(plateletderivedgrowthfactor,PDGF)的致分裂作用,并可抑制有丝分裂原激活的蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)的信号
13、转导 ,调控前胶原 a(I)等基因的表达和 TGF/3 的产生,维持 HSC 处于静止状态.在 HSC 激活过程中,胶原合成增加同时伴有 VitA 的丢失.补充外源性 VitA,可抑制HSC 增殖,激活而降低 ECM 的产生.Imai 等g实验提示,纤维化大鼠肝 HSC 在含有大量 VitA 脂滴时,其合成胶原纤维的能力被抑制,即使在肝损伤持续存在的情况下亦是如此.2.1.3 过氧化质体增殖物激活的受体(peroxisomeproliferator-activatedreceptor7,PPAR7)激动剂PPAR7 是一类由配体激活的核转录因子,属于类固醇视黄醛衍生物核受体家族成员.近来研究表
14、明,中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin2004May;20(5).483.PPARy 对维持 HSC 处于静止状态的表型,抑制肝脏局部炎症,诱导巨噬细胞凋亡有重要作用.在肝纤维化大鼠的 HSC 细胞中 PPAR7mRNA 表达明显减少,PPARy 激动剂 15 脱氧占(12,14) 前列腺素通过上调 PPARy 的表达,在体外培养中可抑制HSC 的激活,减少 HSC 激活产生 aI(1)型胶原,一SMA 等激活标志物的表达量,拮抗 PDGF 对 HSC的激活增殖作用.其它 PPAR7 激动剂还有不饱和脂肪酸,胰岛素,非甾体类抗炎药,花生四烯酸的代谢产物
15、等.2.1.4 拮抗整合素(Integrin)整合素是一种分布于细胞表面的跨膜糖蛋白,属黏附分子家族,是ECM 主要受体,介导细胞一 ECM 或细胞一细胞问黏附及细胞内外信号传递.在肝纤维化过程中,HSC,HC 细胞膜上整合素被诱导表达,激活酪氨酸激酶,通过磷脂酰肌醇 3 激酶(phosphatidylinosito13 一 kinase,PI3 一 K),粘着斑激酶 (focaladhesionkinase,FAK)等信号分子相互作用,偶联,刺激MAPK 级联反应 ,参与 HSC 的激活增殖,收缩,黏附的调节.整合素作为一类重要的细胞黏附分子已成为治疗肝纤维化的靶标之一.精氨酸一甘氨酸一天冬
16、氨酸(Arg-GlyAsp,RGD) 三肽序列是整合素与配体结合的识别位点之一,Bruck 等利用含 RGD序列的模拟化合物能抑制硫代乙酰胺诱发的大鼠肝纤维化的形成.1wamoto 等 u 用含有 RGD 序列的可溶性五肽类似物 GRGDS 处理体外培养的大鼠HSC,结果显示,GRGDS 能抑制 HSC 胶原纤维的产生,降低 aSMA 的表达,解除细胞的黏附,诱导HSC 凋亡.Kato 等妇发现,FN 含有一段隐性功能位点 FN14,能阻断某些细胞与 ECM 的相互作用及其后续的细胞内信号转导,且效率远高于可溶性 RGD 肽,因此,研究 FN11114 与整合素的相互作用将给肝纤维化的防治提供
17、新的思路.2.1.5 拮抗局部内分泌激素近年研究表明,血管紧张素的基因型与人类肝纤维化的发生发展有密切关系1. 人和大鼠 HSC 均表达血管紧张素(angiotensin,Ang),Ang 1 型受体(AT 一 1R),血管紧张素转换酶(ACE). 在肝纤维化过程中,HSC 合成的 Ang通过自分泌或旁分泌作用,激活 HSC,并通过刺激 TGFI3 的合成和分泌,促进 HSC 分泌ECME.ACE 抑制剂依那普利和 AT 一 1R 拮抗剂洛沙坦能明显抑制体外培养的 HSC 增殖,阻断Ang的促肝纤维化作用“一.此外.血管收缩剂内皮素一 1(Endothelin 一 1,ET 一 1)及其受体(
18、Endothelinreceptor,ETR)在激活 HSC 致肝纤维化中的作用也引起了人们的重视,在肝纤维化早期,HSC 主要表达 ET 型受体,ET 一 1 通过增加细胞内钙离子浓度,表现为促进细胞收缩,增殖活性.到后期,HSC 以表达 ET 受体为主,ET 一 1 通过 cAMP 抑制MAPK 活化, 从而抑制细胞增殖.因此选择性拮抗ETA 型受体可能成为抗肝纤维化治疗的一个有效途径.2.1.6 抗氧化剂氧化应激与 HSC 的激活和肝纤维化形成有密切关系.多项研究发现,氧化剂通过作用于多种转录因子,调控与肝纤维化相关的基因表达,诱导 HSC 激活,尤其在激活早期.VitE 是一种传统的抗
19、氧化剂,能减轻肝脏炎症,保护肝细胞,抑制 HSCIll 型前胶原基因表达,增加组织金属蛋白酶 MMP.mRNA 的表达 .此外,西利马林,N 一乙酰半胱氨酸,白藜芦醇等具有与 VitE 相似的作用.雌激素作为一种自身抗氧化剂,它与肝纤维化的关系近年来引起了人们的注意,Shimizu 等口给舍大鼠补充不同剂量的雌激素,能抑制 DMN,猪血清诱导的肝纤维化形成,其抑制程度与剂量成正相关.Evans 等口研究发现 ,雌激素通过作用于受体,能抑制肝内核因子一 B(nuclearfactorKappaB,NFxB)水平及炎症基因的表达,从而抑制 HSC 的激活.2.2 针对细胞因子的药物在肝纤维化过程中
20、,细胞因子参与 HSC 的激活,增殖和 ECM 的合成与降解,其中 TGFI 和 PDGF 是最重要的促纤维化因子,有效拮抗和调控它们的活性对抗纤维化的研究具有重要意义.另外,有一些天然的具有抗肝纤维化的细胞因子近年来受到人们的重视,如肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF),白细胞介素10(interleukin10,IL 一 10)等.2.2.1TGFI 在肝纤维化中,TGFI 大量分泌,经过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体及其下游效应分子Smad 蛋白家族的转导,并作用于靶基因,激活 HSC转化为肌成纤维细胞(myofibroblast,MFB),提高I, 型前胶
21、原含量,抑制基质胶原酶的产生,促进基质金属蛋白酶抑制剂一 1 的产生.毫无疑问,TGFI 是一个重要的促纤维化介质,抑制其活性是治疗肝纤维化的一种有效手段.近年来,已探索应用各种方法拮抗 TGFI 的作用 :TGFI 抗体.研究表明,TGFI 抗体可下调培养 HSC 细胞膜上的PDGF 一 8 受体量,细胞增殖和 ECM 合成受到明显抑制.Schuppan 等报道,应用 TGFI 抗体静脉注射治疗结#LHH 总管造成的大鼠肝纤维化获得较好的效果.变异 TGFI 受体.Qi 等用腺病毒作为484.中国药理学通报(,2P“fulogic“,Bullti,22004May;20(5)载体,构建型 T
22、GFI 受体显形失活体(AdcATTR),经门静脉注入,结果发现能抑制DMN 诱导的肝纤维化形成,明显改善大鼠生存率.可溶性 TGF3H 型受体.利用腺病毒载体将TGF81I 型受体基因导人体内骨骼肌细胞以表达可溶性受体,与活性 TGF8 结合并阻断其信息的传递.在动物实验已证实有抗肝纤维化的效应.此外,应用反义 TGF?基因或抑制性基因导入技术来阻止TGF8 基因转录或翻译,为阻止肝纤维化提供了一新思路.2.2.2PDGFPDGF 是目前已知的体外 HSC 最强的丝裂原,通过激活细胞外信号调节蛋白激酶(extracellularsignalregulatedkinase,ERK)和磷脂酰肌醇 3 激酶(phosphatidylinositol3 一 kinase,PI3 一K)活性,催化 c-jun,cfos,cmyc 及核糖体 S6 蛋白激酶(RSK)的磷酸化,从而调节 HSC 的分化,分裂及 ECM 合成.此外,PDGF 通过升高细胞内 Ca浓度,增加 Na+-H 泵活力,促进细胞增殖.己酮可可碱(PTX) 是一种甲基黄嘌呤,它对 PDGF 受体有
