1、肝再生与线粒体蛋白释放的关系?306?文章编号:10OO 一 1336(2005)04-0306-03生命的化学)2005 年 25 卷 4 期CHEMISTRYOFLIFE2005,25(4)MjnjReviews肝再生与线粒体蛋白释放的关系周运恒于军王璐时多缪明永(第二军医大学生物化学与分子生物学教研室,上海 200433)摘要:在肝部分切除或创伤后,残存肝组织很快就进入复杂的再生过程 .在肝再生过程中,线粒体发挥着重要的作用.不仅提供能量,而且参与细胞的信号转导等活动.近年来众多研究表明,在肝再生过程中线粒体透性转换有明显特征性的变化,并具有一定的规律性;同时发现 ,在肝再生早期有一些线
2、粒体基质蛋白释放到胞液中,提示线粒体蛋白的释放可能与肝再生之间具有一定的关系.关键词:肝再生;线粒体;蛋白质释放中图分类号:O5l肝再生是肝脏在受到损伤时产生的复杂的生理学反应,包括基因的表达,生长因子的产生,蛋白质的调控和形态结构的变化等等.目前对肝收稿日期:2005 一 o518国家自然科学基金资助项目(No.30070346)作者简介:周运恒(1976 一),男,硕士生,检验医师,Email:zhouyh2008126.eom;缪明永(196l 一 1,男,副教授,硕士生导师,联系作者,Email:miaomy1980hotmail.eom白质及寡核苷酸在药学领域的应用大大受限.相比之下
3、,穿膜肽在这方面显然具有很大优势:细胞膜亲和性高,穿膜速度快,可迅速被降解,最重要的是对细胞膜没有破坏性 I9I.以 penetratin 为代表的穿膜肽可有效将多肽,蛋白质分子及 DNA 片段,通过无受体介导,无耗能的方式,导入多种 N-%动物细胞,且在一定浓度范围内不会造成细胞损伤.将它们作为生物活性分子的细胞内转运工具,应用于细胞生物学,基因治疗,药物体内转运,临床药效评价等领域,具有诱人的前景.其中 HIV 的转录活化因子Tat 蛋白的 48-60 氨基酸片段(GRKKRRQRRRPPQ)不仅可将靶蛋白带人胞质内,而且还能使靶蛋白聚集于核内.并在接头(1inker) 的羧基末端插入静止
4、细胞脯氨酸二肽酶(quiescentcellprolinedipeptidase,QPP)的特异蛋白酶裂解位点(xAlaPro),QPP可特异识别并降解 XAlaPro 序列位点 I.QPP是胞内蛋白酶,定位于 T 淋巴细胞,巨噬细胞,成纤维细胞和内皮细胞等炎性细胞质中类似溶酶体但又与溶酶体不同的一种泡状小体内,.我们可以根据这个特点,设计载体,使引导肽将目标再生进行了大量分子生物学研究,发现包括激素,生长因子和细胞因子,以及相关基因和转录因子参与了这个过程,但是对肝再生的分子生物学机制,尤其是肝再生的启动和终止的机制仍不清楚.线粒体作为细胞生命活动中一个非常重要的细胞器,它不仅为细胞活动各个
5、环节提供所需的能量,而且直接参与细胞内许多信号转导.研究分子引入细胞以后,自身被特定的酶识别,切割下来并被降解,从而不影响目标分子的作用.在应用方面,对于相对较大的分子,如核酸,多肽,甚至直径达 200nm 的顺磁性颗粒进入细胞,穿膜肽都是非常合适的载体.100bp 以下的寡聚核苷酸,DNA,甚至 RNA,都被成功地引入到细胞内.此外 siRNA111.121 也被成功地引入到细胞内,100 个氨基酸残基以下的多肽都可以成功地穿膜.参考文献1】DerossiDeta1.JBiolChem,1994,269:1O4441045021ThorenPEef.腰 Lett,2Ooo,482:26526
6、83】MagzoubMeta1.BiochimBiophysActa2002,l563:53634MagzoubMeta1.BiochimBiophysActa,2002,1563:53635DerossiDet.JBiolCh,1996,271:1818818193【61AnderssonAefa1.BioehimBiophysActa,2004,l66l:l8257BinderHeto1.Biophys2004,87(1):3323438BelletAmalricEeta1.BiochimBiophysAeta,2000.14671311439LindgrenMEeto1.Biochem2
7、Oo4,377:697610ChiravuriMeta1.Jlmmunol,2000,165:5695-5702【l1】TroyCMeta1.JNeurosci,2004,24(45):100I40 10046l2】MuratovskaAeto1.腰 BSLett,2004.558(13):6368小综述生命的化学)2005 年 25 卷 4 期CHEMISTRYOFLIFE2005,25(4)表明线粒体透性转换(MPT)是这一切功能的重要环节,与细胞许多生命活动(增殖,凋亡,损伤,修复和衰老等)有关【21.过去对 MPT 研究最多的是其在细胞凋亡和坏死过程中的作用.近年来的一些研究发现,在肝
8、再生过程中,MPT 的变化伴随一些线粒体基质蛋白的释放,而这些蛋白质的释放可能与线粒体通透性转换孔(permeabilitytransitionpore,PTP)的开闭有关【引.如果肝再生过程中 MPT 的变化与线粒体蛋白释放存在一定的关系,那么线粒体可能就是肝再生过程的一个重要调节点,可能与肝再生的启动和终止有关.1.肝再生与线粒体关系研究现状上个世纪 90 年代以来,肝再生与线粒体关系的研究逐渐受到重视,获得了一些重要的结果,主要表现在以下几个方面.1.1 线粒体氧化磷酸化变化肝再生时一般表现为氧化磷酸化功能增强,但 1995 年 Guerrieri 等发现大鼠肝部分切除(70%parti
9、alhepatectomy,PH)后早期(PH 后 024h),短暂性的出现氧化磷酸化能力降低,之后恢复,进而明显增强,4 天时达到高峰.1999 年缪明永等阁研究发现:大鼠肝再生过程(在 PH 后 0-7 天)中,线粒体氧化磷酸化变化时相上有两个峰,分别为 0.5 天和 4 天,1 天为最低点;并分析了线粒体呼吸态 3(R)和呼吸态4(R4)的变化 ,发现 R4 的变化更明显,而 R4 反映的是线粒体内膜的结构特性,提示线粒体氧化磷酸化变化与线粒体膜通透性改变有关.1.2 自由基的变化研究发现氧化磷酸化的变化与肝线粒体内自由基的变化呈明显的消长关系:在肝再生早期,线粒体氧自由基含量上升,同时
10、伴有脂质过氧化增高,还原性谷胱甘肽下降和氧化磷酸化酶的损伤等.一般认为细胞内自由基升高有利于细胞分化和再生,而线粒体是细胞内产生自由基的主要场所,其产生与呼吸链电子溢出有关,而后者是由线粒体内膜通透性增加所致【6】.1.3 肝细胞凋亡活性的变化研究发现,肝再生与肝细胞的凋亡活性呈明显消长关系.在 PH后 1 天(肝大部分切除后 1 天),检测不到明显的细胞凋亡,1 周后细胞凋亡活性明显增强,促细胞凋亡因子 Fas 和 FasL 早期表达很低,以后升高,5 天达到高峰,而抑制细胞凋亡因子 Bcl 一 2早期表达增强,5 天后下降【7J.许多研究表明,细胞凋亡活性变化可能与肝再生过程中肝的重塑及肝
11、再生后期终止有关,可通过线粒体通透性大小来调节线粒体一些蛋白质的释放,如细胞色素 C,凋亡诱导因子(apoptosisinducedfactor,AIF),核酸内切酶 G,Smac/DIABLO(mitochondfial-defivedactivatorofcaspase),Omi/HtrA2 等释放出来而具有凋亡活性,从而影响细胞凋亡过程8.以上研究结果表明,线粒体与肝再生过程密切相关,而线粒体的变化和肝再生后期细胞凋亡活性增强可能与 MPT 变化有关 ,而 MPT 的物质基础又是 PTP,提示肝再生过程与 PTP 和 MPT 的变化密切相关.2.PTP 的结构和特性PTP 是线粒体内膜和
12、外膜接触点处存在的一种蛋白性孔道复合物,目前对其分子组成研究得还不太清楚,普遍认为它是由一些蛋白质组成的复合体,包括电压依赖阴离子通道蛋白(VDAC),腺苷酸转位体(ANT), 亲环蛋白 D(cyclophlinD),外周型苯二氮卓受体(PBR),以及Bcl 一 2 家族一些成员(Bcl 一 2,Bad 和 Bax)等.PTP 具有可逆性开闭的特性,正常的低通透性开放只允许分子量小于 1500 道尔顿的分子通过,异常的高通透性开放会导致线粒体跨膜电位消失和凋亡因子释放等.PTP 是线粒体内外信息交流的环节,功能的发挥依赖于其开闭的状态.多种因素可调节 PTP 开闭,例如细胞氧化还原水平 ,能量
13、代谢水平,金属离子和一些药物等,其中可以诱导 PTP 开放的因素有:Ca,ADP, 苍术糖和活性氧簇(Ros)等,抑制 PTP 开放的因素有:H,Mg2,辅酶 Q,环孢菌素 A(CsA,MPT 专一性抑制剂),米酵菌酸和 Ca 螯合剂等 .3.MPT 变化规律2004 年缪明永等系统研究了肝再生整个过程(PH 后 0-7 天)的 MPT 变化规律,发现在大鼠肝再生早期(PH 后 01 天)和后期(PH 后 5-7 天)都表现为肝线粒体先收缩后肿胀的特征性变化,也即通透性先下降后增高.例如:PH 后 3h 和 6h 肝线粒体悬液 D540(线粒体悬液在 540nm 处光密度值)明显增高,提示线粒
14、体有一定的收缩,这种线粒体收缩可能与肝再生早期线粒体氧化磷酸化偶联增强有关;之后逐步下降,至 PH 后 24h 降到最低点,这表示线粒体通透性明显升高和线粒体明显肿胀,反映了线粒体氧化磷酸化有一定程度解偶联,而一定程度解偶联可加速线粒体氧化呼吸速度;同时这种通透性提高可能也有利于线粒体与胞质之间的分子转运.在肝再生后308?生命的化学)2005 年 25 卷 4 期CHEMISTRYOFLIFE2005,25(4)期,线粒体又经历了收缩和肿胀的变化过程,提示后期线粒体的肿胀变化可能与肝再生后期的终止过程有关.4.线粒体蛋白的释放在上世纪 80 年代,Igbavboa 等 fI2】就提出 MPT
15、的变化会引起一些基质蛋白和小分子及离子从线粒体基质内释放出来.但到 90 年代以后才发现在肝再生过程的早期,MPT 发生变化 ,线粒体基质的一些蛋白质可以通过 PTP 释放到细胞液中,从而引起线粒体,细胞液和其他部位中这些酶活性的改变.1998 年 Greco 等 I1通过测定酶活性的方法,最早发现在肝再生的复制前期(PH 后 0l 天),线粒体基质内的天冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,AAT)和苹果酸脱氢酶(malatedehydrogenase,MDH)释放到细胞液中的酶活性逐渐上升,之后慢慢下降;通过离体试验研究发现,CsA 可以抑制线粒体基质蛋白的
16、释放,到 PH后 5 天时,这两种酶在细胞液和线粒体内的活性已基本恢复正常.2002 年,Guerrieri 等 fl4】通过离体试验进一步证实了在肝再生的复制前期,线粒体发生了如下变化:(1)膜的超微结构发生改变,线粒体嵴间腔结构遭到破坏,嵴和致密颗粒的数量下降;(2)线粒体内膜对蔗糖的通透性增加,导致 AAT 和MDH 的释放,PH 后 24h 时的线粒体经培育后释放到上清液中的 AAT 和 MDH 酶活性明显增加;(3)线粒体内的 Ca 浓度增加 ,同时发现提高线粒体培育上清液内的 Ca2 浓度,可以增加 AAT 和MDH 的释放.而在复制阶段后期(PH 后 57 天),线粒体膜的超微结
17、构和通透性以及 Ca 浓度都已经恢复到正常,提示在肝再生过程中,线粒体膜的超微结构改变是由 MPT 引起的,而 MPT 的变化可能与 Ca 浓度有关,线粒体基质蛋白的释放可能与 PTP 的开放有关.MoralesGonzalez 等1516I 通过一系列的研究发现,在肝再生的复制前期,谷氨酸脱氢酶(glu.tamicaciddehydrogenase,GDH),AAT,MDH 也发生了类似的变化,在线粒体内的酶活性都发生不同程度的降低;在此过程中胞液中的乳酸脱氢酶(1actatedehydrogenase,LDH)的活性只是轻微的下降;而整个再生过程中,线粒体膜上的细胞色素 C 和环氧合酶 I
18、 并不释放到胞液中.提示在肝再生的复制前期,线粒体膜对基质内的蛋白质MReviews有明显的选择性通透,与胞液和线粒体膜上的蛋白质相比,基质内的一些蛋白质可优先释放到胞液中.同时发现通过对肝再生模型注射低剂量酒精(1.5g/kg 体重), 可以抑制由 PH 引起的肝脏结构改变,从而降低线粒体蛋白的释放,而高剂量酒精(5g/kg 体重) 注射可以延迟肝再生的发生 ,并能增强线粒体膜的通透性能力.综上所述,在肝再生过程中,线粒体内膜的超微结构和生理特性发生改变,尤其是早期和后期 MPT 的改变和 P 的开闭状态变化 ,从而引起线粒体基质内不同的蛋白质释放到胞液或上清液中,而这种改变可能是线粒体与细
19、胞之间存在信息交流的基础,也即线粒体可能会释放出某些起信使作用的分子,这些分子可能与肝再生的启动和终止有关.鉴于此,我们可以从以下几个方面去进一步研究:(1)MPT 的变化与线粒体蛋白释放的时相关系,尤其是肝再生后期线粒体通透性的改变是否也伴有线粒体蛋白释放;(2)建立完整的肝再生过程中线粒体蛋白释放谱.目前的研究只是从肝再生早期肝细胞液和线粒体培育上清液中检测到了几种已知的线粒体基质酶活性,而对可能释放的其他蛋白质未做进一步研究.因此,可以运用蛋白质组学技术和质谱技术,分析并发现其中线粒体蛋白释放过程中可能存在的一些具有信使作用的分子,探讨其生理作用,有利于进一步认识线粒体在肝再生过程中的作
20、用和阐明肝再生的分子生物学机制.参考文献1MangnallDeta1.Liverlnt,2003,23(2):12413821DuehenMR.Diabetes.2004,53(1):s961023CromptonM.Biocbem1999,341:233-2494GuerrieriFeta1.BiocbimBiophysActa,1995,1272:951o05缪明永等. 中国病理生理杂志,1999,15(5):3984016CamovaleCEeta1.JHepatol,2000,32(5):798-8047TairaKeta1.EurSurgRes,2001,33(56):334-341
21、8】GranvilleDJeta1.ScientificrJd2002,2(6):1569 15789CromptonMeta1.Biocbimie,2o02.84(23):14315210】ZorattiMeta1.BiocbimBiopbysActa,20051706(1 2):405211缪明永等 .第二军医大学.2004,25(3):292-294【12】IgbavboaUeta/.BiochemBiophysResCommun,1989,161(2):619625【l3】GrecoMeta1.FEBSLett,1998,427(2):l79 一 l8214GuerrieriFeta1.EurJBiocbem,2002,269(13):33o43312【15】Morales-GonzalezJAeta1.DigsSci,1999,44:1963 1974161MoralesGonzalezJAeta1.ArchMedRes,20o4.35:263270
