1、利用TCGA数据库分析 miR-196b 在结直 肠癌患者中的临床表达特征并探索 miR-196b的体外抗5-FU作用 车佳 黄兰兰 娄琼 杨湘玲 刘焕亮 中山大学附属第六医院广东省胃肠病学研究所 中山 大学附属第六医院检验科 摘 要： 目的:研究微小 RNA (miR) -196b在结直肠癌患者中的表达及其临床意义, 探讨 过表达miR-196b的结直肠癌细胞对 5-氟尿嘧啶 (5-FU) 的敏感性。方法:在癌 症基因组图谱 (The Cancer Genome Atlas, TCGA) 公共数据库下载结直肠癌患 者miRNA 测序数据及其对应的临床病理资料, 运用SPSS 17.0分析 m
2、iR-196b在 结直肠癌患者中的表达水平以及临床特征;采用瞬时转染的方法在人结直肠癌 HCT116细胞中过表达miR-196b, 并用MTS法分析过表达miR-196b的细胞对5-FU 药物敏感性的变化。结果:miR-196b高表达与结直肠癌患者淋巴结转移及 TNM分 期相关 (P0.05) , 与年龄和性别等无相关性。淋巴结转移和远处转移是直肠癌 患者生存的独立影响因子 (P0.05) , miR-196b的表达水平与患者生存状况无 关。过表达miR-196b 的HCT116细胞在不同浓度的 5-FU作用下, 细胞存活率均 明显高于对照组 (P0.05) 。结论:miR-196b 可能是结
3、直肠癌患者肿瘤分期和淋 巴结转移的分子标志物, 并可降低结直肠癌细胞对 5-FU的敏感性。 关键词： 结直肠癌; 癌症基因组图谱; 微小RNA-196b; 5-氟尿嘧啶; 抗药性; 作者简介：杨湘玲, Tel:020-38455501;E-mail:; 作者简介：刘焕亮, Tel:020-38455491;E-mail: 基金：广东省自然科学基金资助项目 (No.2015A030310096) Analyzing clinical characteristic of miR-196b in human colorectal cancer using TCGA and effect of miR
4、-196b on 5-FU resistance of CRC cell line CHE Jia HUANG Lan-lan LOU Qiong YANG Xiang-ling LIU Huan-liang Guangdong Institute of Gastroenterology, The Sixth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University; Abstract： AIM: To investigate the clinical characteristics of microRNA ( miR) -196 b in colorectal
5、cancer ( CRC) and to study its biological function in 5-fluorouracil ( 5-FU) resistance. METHODS: miRNA sequence dataset and the corresponding clinical data of CRC patients were downloaded from The Cancer Genome Atlas ( TCGA) . Expression level and clinical characteristics of miR-196 b in CRC patien
6、ts were analyzed using SPSS 17. 0. CRC cell line overexpressing miR-196 b was established using transient transfection method. MTS test was used to evaluate the effect of miR-196 b overexpression on 5-FU resistance. RESULTS: miR-196 b expression was associated with lymph node metastasis and TNM stag
7、e ( P 0. 05) , but not related with age and sex. Lymph node metastasis and distant metastasis were independent prognostic factors for rectal patients ( P 0. 05) . The expression level of miR-196 b was not associated with survival condition of rectal patients. The viability of the cells overexpressin
8、g miR-196 b treated with different concentrations of 5-FU was significantly higher than that in control group ( P 0. 05) . CONCLUSION: miR-196 b may be a potential biomarker of TNM stage and lymph node metastasis in CRC. miR-196 b increases the 5-FU resistance of CRC cells. Keyword： Colorectal cance
9、r; The Cancer Genome Atlas; MicroRNA-196b; 5-fluorouracil; Drug resistance; 结直肠癌 (clolrectal cancer, CRC) 是常见的恶性肿瘤之一1-2。2016年的 中国癌症报告表明, 2012 年结直肠癌患者新增人数达 33万, 占恶性肿瘤发病人 数的9.24%, 居第4位, 死亡人数达16万3。 微小RNA (microRNA, miRNA, miR) 是一类长度约为2125个核苷酸的内源性非编码小分子单链RNA, 具有高度保守 的特性, 不直接参与编码蛋白质, 但却可以与靶 mRNA的3端非翻译区 (
10、3-untranslated region, 3UTR) 结合, 通过调节其靶基因的表达进而发挥 重要作用4。miR-196家族包括miR-196a-1、miR-196a-2和miR-196b, 其中, miR-196a-1和miR-196a-2参与多种实体瘤的发生和进展, 如乳腺癌5、骨肉 瘤6、结直肠癌7、口腔癌8、恶性胶质瘤9及胃癌10;miR-196b位于第 7号染色体上 (7p15.2) , 处于HOXA9和HOXA10 基因之间进化高度保守的区域 内11。 为探索miR-196b在结直肠癌患者中的表达水平和临床意义以及其与CRC 临床一线用药5-氟尿嘧啶 (5-fluorourac
11、il, 5-FU) 敏感性的关系, 我们在癌 症基因组图谱 (The Cancer Genome Atlas, TCGA) 数据库中下载结直肠癌 miRNA 测序数据及其对应的临床病理资料, 运用SPSS 17.0 分析miR-196b 在结直肠癌 患者中的表达水平及相对应的临床特征。 同时采用瞬时转染的方法在结直肠癌细 胞株HCT116 中过表达 miR-196b, 探索过表达 miR-196b的HCT116细胞对 5-FU 敏感性的变化, 为下一步研究 miR-196b在结直肠癌中的调控机制奠定基础。 材料和方法 1 实验材料 人源结直肠癌细胞株 HCT116来自美国模式培养物集存库 (A
12、merican Type Culture Collection, ATCC) 。RPMI-1640 培养基和胎牛血清 (Gibco) ;Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) ;Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit、Mir-X miRNA qRT-PCR SYBRKit和SYBRPremix Ex TaqII (Ta KaRa) ;miR-196b mimics和miRNA NC (上海吉玛制药技术有限公 司) ;5-FU (Sigma) 。Bio-Rad T100PCR仪 (Thermal Cycle
13、r) ;System Light Cycler96荧光定量 PCR仪 (Roche) ;全波长多功能酶标仪 (Thermo) 。 2 方法 2.1 采用瞬时转染的方法建立过表达 miR-196b 的HCT116 细胞并测定转染效率 取对数生长期的细胞, 按照常规方法对细胞进行消化、传代和计数, 按每孔 2.510细胞接种至 6孔板, 加入2 m L完全培养基, 细胞培养箱内培养过夜。 第2天取出 6孔板, 在显微镜下确认细胞贴壁生长后, 弃去培养基, 先更换成 1.5 m L没有加入抗生素的培养基, 分别取20mmol/L的miR-196b mimics和miRNA NC 510L, 加入到
14、125L无血清Opti-MEM 培养基中;同时, 另取 125L的 Opti-MEM 培养基加入一只新的离心管, 稀释 3.75L Lipofectamine 3000, 轻 吹混匀。将以上配好的 2种试剂混合, 轻吹混匀, 在室温条件下静置 510 min, 把上面形成的脂质体混合物加入 6孔板, 轻轻摇晃并置于培养箱内培养。 关于转 染效率的测定, 我们采用以上方法把带有荧光基团 FAM标记的miR-196b mimics和miRNA NC 转染至 HCT116细胞中, 在转染后的 6 h和12 h, 取出培养皿至荧 光显微镜下用高倍镜观察, 随机选取视野进行拍照计数, 计算转染效率。 2
15、.2 过表达 miR-196b 的细胞总 RNA 的提取 将培养皿取出置于超净台, 弃去培养基, 再用 PBS洗1次, 加入1 m L TRIzol 试剂, 于室温放置35 min后转移到1.5 m L的离心管中。 每支离心管加入200L 氯仿, 充分振荡混合后, 室温放置10 min。4、12 000 r/min 离心 15 min, 将 约400L 上层清液转移入新的离心管中, 加入等量的异丙醇, 轻柔混匀, 室温 放置10 min, 4、12 000 r/min离心10 min。小心去上清, 保留离心管底部 的白色团块, 用DEPC 处理水配制的75%乙醇洗涤。4、7 500 r/min
16、 离心5min, 弃上清。 室温自然风干, 待白色团块变为无色透明后, 用DEPC处理水溶解, Nano Drop测 RNA浓度。 2.3 采用 real-time PCR 检测miR-196b 的表达 本实验使用加尾法检测 miR-196b的表达水平, 其中5端引物为 5-AGGTAGTTTCCTGTTGTTGGG-3, mRQ3端引物及 U6引物为该公司商业引物。 按照MirX miRNA First-Strand Synthesis Kit 的说明配制10L逆转录反应体 系:mRQ Buffer (2) 5L、RNA sample (0.258g) 3.75L 和 mRQ Enzyme
17、1.25L, 逆转录反应条件为 371 h, 855 min。逆转录得到的c DNA 用dd H2O 按照110 稀释。miR-196b的荧光定量PCR 反应体系为:dd H2O 9.5L、SYBR Advantage Premix (2) 12.5L、 miRNA-specific primer (10mol/L) 0.5L、 mRQ 3primer 0.5L 和c DNA 2.0L;反应条件为 95预变性30 s, 95变 性5 s, 60退火30 s。U6反应体系为dd H2O 9.5L、SYBR Advantage Premix (2) 12.5L、U6 forward primer
18、(10mol/L) 0.5L、U6 reverse primer (10mol/L) 0.5L 和c DNA 2.0L, 反应条件同 miR-196b。以U6 为内参照, NC组为对照组, miR-196b组为实验组, 计算基因差异表达的倍数, 计算公式为 2, 其中 Ct=Ct 目的基因-Ct 内参照基因, Ct=Ct 实验组-Ct 对照组。 2.4 采用 MTS 法检测细胞对 5-FU的敏感性 分别取转染miR-196b mimics 和miRNA NC的细胞, 按照常规方法对细胞进行消 化、 传代和计数, 调整细胞密度, 每孔210 接种到96孔板中, 培养细胞过夜。 次日, 按照需要把
19、5-FU用培养基稀释成不同的浓度梯度, 每个浓度做3个复孔, 滴加于接种有细胞的96孔板里。 在培养箱里放置72 h后, 每孔加入10L WST-1, 37静置 1030 min, 待完全溶解后, 用全波长多功能酶标仪在波长为 450nm处 测定样品的吸光度 (A) 值, 进一步计算细胞存活率。 3 统计学处理 数据处理统一使用 SPSS 17.0统计软件。计量资料以均数标准差 (meanSD) 表示。 运用Shapiro-Wilk法检测miR-196b表达水平的分布情况, 如果符合正态 分布, 采用参数检验方法分析 miR-196b表达水平和结直肠癌临床病理参数的关 系;如果不符合正态分布,
20、 则运用Wilcoxon 秩和检验 (二分类变量) 。 使用中位数作为miR-196b表达水平高低的分界值。采用 Kaplan-Meier法建立 miR-196b 的生存曲线, Logrank 检验比较miR-196b表达水平不同的患者生存曲线的差异 及意义;采用COX回归法分析miR-196b与其它临床参数对结直肠癌患者预后的影 响;采用卡方检验分析 miR-196b的表达水平和其它临床参数的相互关系;采用单 因素方差分析过表达 miR-196b 的HCT116细胞在不同 5-FU浓度下细胞存活率的 统计学差异。以P0.05 为差异有统计学意义。 结果 1 miR-196b 在结直肠癌患者中
21、的表达与临床特征的相关性 利用统计软件SPSS 17.0 对miR-196b在结直肠癌患者中的表达情况进行分析, 结果显示, miR-196b 的表达水平与直肠癌的淋巴结转移 (P=0.045) 、TNM分期 (P=0.043) 及结肠癌的局部浸润相关 (P=0.028) , 见表1、2。 用Shapiro-Wilk法检测直肠癌患者中有淋巴结转移 (N1+N2) 和无淋巴结转移 (N0) 两组患者 miR-196b表达水平的分布情况, 结果显示不符合正态分布, 故 采用Wilcoxon秩和检验对两个独立样本进行分析, 发现miR-196b的表达水平与 淋巴结转移相关 (P=0.020) , N
22、1+N2 期miR-196b的表达水平高于N0 期, 即 miR-196b 在有淋巴结转移的组织中表达量升高, 见图1。在直肠癌患者的 TNM 分期中, 我们发现 I+II期和III+IV期患者间 miR-196b表达水平的差异也有统 计学意义, III+IV 期的直肠癌患者miR-196b 的表达水平高于I+II 期患者 (P=0.018) , 见图 2。 表1 miR-196b在直肠癌中的临床表达特征 Table 1.Clinical characteristics of miR-196b in 158 rectal canc-er patients 下载原表 表2 miR-196b在结肠
23、癌中的临床表达特征 Table 2.Clinical characteristics of miR-196b in 407 colon canc-er patients 下载原表 Figure 1.The correlation between miR-196b expression and lymph node metastasis.Median (interquartile range) .图1 miR-196b在结直肠癌组织中 的表达水平与淋巴结转移的关系 下载原图 *P0.05 vs N0 group. 2 miR-196b 在结直肠癌患者中的表达与生存状况的关系 在SPSS 17.0
24、中运用 COX回归法分析患者的临床信息即年龄、性别、TNM分期以 及miR-196b的表达水平是否是患者生存状况的影响因素。对于直肠癌患者, TNM 分期中的淋巴结转移 (P=0.010) 和远处转移 (P=0.017) 是患者生存状况的影 响因素, 而miR-196b 的表达与患者生存无关, 见表3。对 miR-196b 的表达水平 以中位值进行高低分组后, 运用Kaplan-Meier 法对2组直肠癌患者的生存曲线 进行比较, 发现高表达组和低表达组的生存曲线差异无统计学意义 (P=0.966) , 见图3。 Figure 2.The correlation between miR-196
25、b expression and TNM stage.Median (interquartile range) .图2 miR-196b在结直肠癌组织中的表达水平与 TNM 分期的关系 下载原图 *P0.05 vs stage I+II group. 表3 影响 158例直肠癌患者生存状况的危险因素分析 Table 3.Univariate and multivariate analysis of potential risk factors in 158 rectal cancer patients 下载原表 Figure 3.Kaplan-Meier survival analysis i
26、n 158 CRC patients.图 3 miR-196b 的表达水平与结直肠癌患者的生存关系 下载原图 3 过表达 miR-196b 为研究miR-196b在结直肠癌细胞中的生物学功能, 我们在结直肠癌细胞株 HCT116中分别瞬时转染 miR-196b mimics和 miRNA NC, 和对照组相比, 过表达 组的miR-196b表达水平明显升高, 表明过表达成功, 见图4。 4 miR-196b 促进结直肠癌细胞对 5-FU的抗药性 为了检测miR-196b在结直肠癌细胞中对5-FU作用的影响, 我们进行了药物敏感 性实验。对转染了 miR-196b mimics和miRNA NC
27、 的HCT 116细胞进行梯度浓度 5-FU处理, 培养72 h 后, 利用MTS检测细胞的存活率, 可见过表达 miR-196b 的细胞存活率明显高于对照组 (P0.05) , 表明过表达miR-196b的细胞具有更 强的抗药性, 见图 5。 Figure 4.Overexpression of miR-1 9 6 b in HCT1 1 6 cells.MeanSD.n=6. 图4在 HCT116细胞中过表达 miR-196b 下载原图 .*P0.05 vs NC group. Figure 5.Overexpression of miR-196b increased 5-FU resis
28、tance of CRC cells.MeanSD.n=3.图5过表达miR-196b 促进结直肠癌细胞对5-FU的耐药 性 下载原图 *P0.05 vs NCgroup. 讨论 miRNA广泛参与调节各种生理或病理过程, 其在肿瘤中异常表达, 可参与肿瘤 发生、发展和转移的各个阶段, 如凋亡、增殖、细胞分化及转移等12。已有研 究发现, miR-21、miR-19a、miR-422a和miR-499等是结直肠癌复发与转移的潜 在标志物13-14。 为探索 miR-196b是否可以作为结直肠癌新的分子生物标志物, 我们在TCGA数据库中下载结直肠癌 miR-NA 测序数据及其对应的临床病理资料
29、, 研究miR-196b在结直肠癌患者中的表达水平和临床意义以及其与临床一线用药 5-FU的敏感性的关系。 TCGA计划是由美国国立卫生研究院组织美国国立癌症研究所和国立人类基因组 研究所于2006年启动的大型研究, 旨在全面系统性地了解恶性肿瘤的形成、生 长和转移的生物学基础和病理机制相关的基因组变化, 以促进癌症的早期诊断, 加快治疗癌症的步伐, 并进一步预防癌症。TCGA计划的大部分数据和研究结果 都公开在其网站上, 可以免费下载。 迄今为止, 已有多篇论文在国际知名期刊上 发表15-16。 我们在 TCGA数据库中下载结直肠癌的 miRNA测序数据及其对应的 临床病理资料后分析发现,
30、158 例直肠癌患者 miR-196b的表达水平与 TNM分期 有显著的相关性, 再进一步细化分期时, 即对 T、N和M三个分期分别来讨论分 析时发现, miR-196b 与淋巴结转移密切相关, 有淋巴结转移的患者 miR-196b的 表达水平显著高于无淋巴结转移患者。2013 年, 兰鸿波等17收集了 30例结直 肠癌患者手术后结直肠癌组织及其对应的正常黏膜组织, 运用荧光定量 PCR技 术检测miR-196b的表达水平, 结果显示miR-196b的表达与结直肠癌的淋巴结转 移、肿瘤分期及远处转移均有关, 而与肿瘤部位、大小、大体类型、浸润深度、 组织分化程度、患者的年龄及性别无关, 与我们
31、的分析结果相一致。综上所述, 我们推测miR-196b 与结直肠癌的侵袭和迁移能力相关, 然而其具体的作用机制 还需要进一步探索。 在生存分析中, miR-196b不是结直肠癌患者的独立预后因子, 这一点与已有的 研究相似, 有研究发现, miR-196b与miR-196a 共同作为消化道肿瘤发生发展的 分子标记物, 两者表达水平呈正相关关系, 预测生存结局的特异性和灵敏度都 比任何单独一个要高得多5,7。这种多个基因协同发挥致癌或抑癌作用的机制 并不罕见, 很多功能有相似性的基因相辅相成, Li等18报道在肺癌的研究中 建立一个由8种miRNAs (含有 miR-196b) 联合预测模型,
32、该预测模型能够很好 地预测肺腺癌患者的预后。据此, 我们推测 miR-196b可能与多个miRNA 协同参 与结直肠癌的进展。 研究显示, miRNA可参与影响结直肠癌患者对化疗药物的敏感性, 与患者的化疗 应答密切相关19。 因此我们也探讨了 miR-196b对结直肠癌的5-FU 敏感性的影 响。结果显示, 过表达 miR-196b可降低结直肠癌细胞对 5-FU的敏感性, 表明 miR-196b 可能与结直肠癌的化疗耐药相关。Svoboda等19在2012 年的研究中 发现miR-196b的表达与胸苷合成酶 (thymidylate synthetase, TS) 抑制剂的 化疗抵抗性之间存
33、在着潜在的联系。TS是胸腺嘧啶在合成过程中非常重要的酶, 又是5-FU作为抗肿瘤代谢药物在发挥作用时的关键酶, 这说明miR-196b可能与 5-FU代谢相关的酶之间存在着潜在的关系, 而miR-196b是如何参与到 5-FU的 代谢途径中、miR-196b 的表达跟5-FU相关的代谢酶之间存在着什么样的关系还 需要我们进一步探索。 本研究运用现有的 TCGA数据库, 通过分析肿瘤基因组信息了解肿瘤的发生发展 机理, 进一步发现肿瘤标志物和药物作用基因靶点, 可为癌症的精准诊断和治 疗提供支撑。 在miRNA 水平对结直肠癌相关的测序数据和临床病理数据进行了挖 掘, 发现miR-196b可能和
34、结直肠癌的侵袭和迁移有关, 并与5-FU的化疗敏感性 相关, 对今后 miR-196b参与结直肠癌的分子机制及预后研究有一定的理论指导 意义。 参考文献 1Siegel RL, Miller KD, Jemal A.Cancer statistics, 2017J.CA Cancer J Clin, 2017, 67 (1) :7-30. 2Chen W, Zheng R, Baade PD, et al.Cancer statistics in China, 2015J.CA Cancer J Clin, 2016, 66 (2) :115-132. 3Chen W, Zheng R, Zu
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