1、植入前遗传学诊断四例临床分析中华妇产科杂志 2OO2 年 11 月第 37 卷第 11 期ChinJObetGyneeol,November2002,Vo1.37,No.11植入前遗传学诊断四例临床分析孟祥阁张丽红董云玲李娟王克华江平张梅心胥玉梅【摘要】目的探讨对遗传病高危夫妇采用单细胞荧光原位杂交(FISH)进行胚胎植入前遗传学诊断(PGD)的临床价值.方法对曾生育过遗传病患儿的 4 对夫妇通过超排卵获得卵子,体外受精,体外培养至 68 细胞胚胎,每个胚胎取 12 个细胞,采用 FISH 进行遗传学分析,筛选无遗传病发病风险的胚胎移植入子宫.结果 4 例患者共进行 4 个治疗周期,获得可供活
2、检的胚胎12 个,活检细胞20 个,固定后有核细胞 17 个,FISH 后除 2 个细胞无杂交信号外,其余杂交信号清楚,结果明确.活检后的 12 个胚胎继续发育,结合遗传学诊断,8 个胚胎可供移植,其中 1 例妊娠,于2001 年 9 月 14 日足月剖官产分娩一女婴,发育正常,体重 4270g,出生后染色体检查为正常女性核型.结论对遗传病高危夫妇采用 FISH 技术进行 PGD 具有临床应用价值.【关键词】植入前诊断;分裂球;活组织检查;原位杂交,荧光PreimplantafiongeneticdiagnossMENGXiangge,ZHANGLihong,DONGYunling,LIJua
3、n,WANGKehua,JIANGP,lg,ZHNAGMeixin,XUYumei.ReproductiveMedicalResearchCenter,ShandongInstituteformann/ng,J/nan250002,China【Abstract】ObjectiveToevaluatetheclinicaleffectivenessofpreimplantationgeneticdiagnosis(PGD)forthecoupleshavingahigherriskofgeneticdiseaseswithfluorescenceinsituhybridization(FISH)
4、.MethodsOvarianhyperstimulation,oecyteretrievalandinvitrofertilizationwereperformedin4cases.Blastomerebiopsywereperformedfromtheembryosatthe6-8cellstage.GeneticdiagnosisoWa$identifiedbysingleblastomereFISH.Thefemaleembryosornormalembryosweretransferredintouterus.ResultsTwelveembryoswereavailablefore
5、mbryobiopsy.Twentycellswerecollected.SeventeennucleiwerefoundafterfLxation.Hybridizationsignalsof11enlbryoswereclearand8embryosweretransferredintouterus.OneclinicalpregnancyWqachieved,and1normalfemaleinfantwa$dehveredonseptember14,2001.ConclusionPGDisveryvaluableforavoidingselectiveabortionandbirtho
6、faffectedchildofthecoupleshavingahigherriskofgeneticdiseasesbydetectingembryoSeXandchromosomenumberusingHSH.【Keywords】 Preimplantationdiagnosis;Blastomeres;Biopsy;Insituhybridization,fluorescence植入前遗传学诊断(PGD)是指对配子或植入子宫之前的胚胎进行遗传学分析,去除有遗传缺陷的配子或胚胎,选择健康的胚胎移人母体,为有可能生育遗传性疾病婴儿的夫妇提供生育健康婴儿的机会,并避免其他检查方法可能带来的终
7、止妊娠的痛苦.本中心在 2000 年进行 PGD 临床研究,曾有 4 例高危遗传病夫妇接受 PGD,其中 1 例妊娠并于 2001年 9 月分娩正常健康婴儿.现报道如下.一,研究对象资料与方法基金项目:国家计划生育委员会科学基金资助(98.17)作者单位:250002 济南,山东省计划生育科学技术研究所生殖医学中心.论着.2000 年 112 月期间,本中心应用荧光原位杂交(FISH)技术对 4 例患者进行了 4 个周期的 PGD.其中,例 1 为假肥大型肌营养不良基因携带者,32岁,无家族史,足月顺产 1 男婴,4 岁时诊断为假肥大型进行性肌营养不良;例 2 为血友病 A 基因携带者,28
8、岁,有明显的家族史,孕 6 个多月时胎儿诊断为甲型血友病;例 3 为有 21 一三体和多发畸形生产史患者,32 岁,1998 年足月产 1 男婴,染色体检查为47,XY+21,1 个月时死亡,后又足月产 1 女婴,为多发畸形,产后 3d 死亡;例 4 为有 21 一三体生产史患者,35 岁,第 1 胎足月产 1 女婴,智力低下,诊断为21 一三体综合征,1 岁多时死亡.4 例患者一般情况良好,月经周期规律,妇科检查无异常发现,其他检查正常.二,研究方法中华妇产科杂志 2002 年 11 月第 37 卷第 11 期ChinJOlmtetGyneeol,November2OO2,Vo1.37,No
9、.111.超排卵治疗:4 个周期均采用常规长方案进行超排卵.2.体外受精和胚胎培养:例 13 均行常规的体外受精,例 4 因男方严重少精行卵母细胞胞浆内单精子显微注射.3.卵裂球活检:于取卵后第 3 天上午对 68 细胞期胚胎活检,每个胚胎取 12 个细胞,活检参照文献2的方法 (图 1).4.遗传学分析:采用单细胞 FISH 技术检测胚胎的染色体数目和胚胎性别.(1)活检细胞低渗固定:将活检得到的单细胞移入低渗液(0.068mol/L 氯化钾+0.1%牛血清白蛋白)中 1min,再将细胞移入载玻片,在解剖镜下见细胞膨胀,开始滴固定液(甲醇:冰醋酸为 3:1),将细胞浆完全去除,然后用相差显微
10、镜进行核定位.(2) 探针准备:所用探针均为美国 Vysis 公司生产.其中,用染色体计数探针(chromosomeenumerationprobe,CEP)系列的 x,Y 染色体混合探针进行胚胎性别诊断,x 染色体探针用桔红色标记,Y 染色体探针用绿色标记;CEP 系列 x染色体探针用绿色标记;用染色体特异位点探针(1ocusspecificindentifierprobe,LSI)系列中的 21.染色体探针(桔红色标记), 进行胚胎 21 号染色体数目检测.例 1,例 2 用 CEP 系列 x,Y 染色体混合探针;例3,例 4 用 CEP 系列 x 染色体探针和 LSI 系列 21.染色体
11、探针.(3) 杂交:将探针加入载玻片标记细胞核的位置,盖上小盖玻片,用封口胶封好盖玻片.将玻片平放入杂交仪,80C,3min 复合变性后将玻片放入湿盒中,37水浴,染色体计数探针孵育 4h 以上,染色体特异位点探针孵育 12h 以上.(4)洗片:杂交后,将玻片放入由 0.4氯化钠,柠檬酸钠缓冲液(SSC)+0.3% 的辛基苯氧聚乙氧基乙醇(NP.40)配成的溶液 1 中,2min 后移入由 2的 SSC+0.1%的 NP-40 配制成的溶液 2 中,室温 1min,洗脱非特异性杂交.(5) 复染:加入 15l4,6.二脒基.2.苯基吲哚中复染.(6) 分析:在尼康 El000 型荧光显微镜下观
12、察结果.每个植入前诊断周期均选用正常男性的淋巴细胞为对照.5.结果评定:例 1,例 2 用 CEP 系列的 x,Y 染色体混合探针,当单细胞同时出现桔红色,绿色两个信号时,诊断为男性胚胎(XY);同时出现两个桔红色信号时,诊断为女性胚胎(XX).例 3,例 4 用 LSI 系列 21.染色体探针和 CEP 系列 x 染色体探针,当单细胞同时出现 2 个桔红色和 2 个绿色信号,诊断为正常女性胚胎(XX,2121).6.胚胎移植:选择经活检后仍继续分裂及 FISH分析为无发病风险的胚胎 13 个移植入子宫,常规黄体支持.7.确定妊娠:同常规体外受精,并于妊娠 1620 周行羊水检查验证 PGD
13、结果.结果4 例患者 4 个治疗周期,共得到 12 个可供活检的胚胎,活检共取到 20 个细胞,活检后 12 个胚胎均能继续发育.活检细胞固定后,17 个细胞可见到细胞核(图 2).杂交后 ,有 2 个细胞无杂交信号,其他均有清晰的信号;11 个胚胎有 FISH 检测结果,4 个男性胚胎,7 个女性胚胎.例 1 假肥大型肌营养不良基因携带者有 2 个女性胚胎(图 3)移植.例 2 血友病 A 基因携带者有 2 个女性胚胎移植,另 2 个男性胚胎未移植(图 4).例 3 仅有 1 个正常男性胚胎(XY,2121),移植 ,另 1 个 3 原核胚胎 FISH 检测结果为 XXX,212121(图
14、5).例 4 移植 3 个正常女性胚胎(XX,2121)(图 6),获得临床妊娠 ,分娩一正常女婴.见表 1.表 14 例患者活检细胞的 FISH 结果(个)讨论一,PGD 的临床意义及安全性目前,对性连锁隐性遗传病,染色体病和单基因遗传病进行的 PGD,可避免妊娠遗传病患儿,与传统的早期产前诊断相比,免除了终止妊娠对母亲身心的损伤.因此,PGD 的临床应用具有积极意义.PGD 首先是对 68 细胞期胚胎进行卵裂球活检,因此活检是否会影响到胚胎的进一步分化及发育,是开展 PGD 技术首先关注的问题.大量的实验结果及临床研究表明,早期胚胎活检后分裂速度稍慢_3J,并不影响胚胎的进一步分化和发育_
15、4J,这可能与此期细胞的基因组尚未激活,细胞问紧密连接尚未发生有关 J.本资料例 4 的 3 个胚胎活检后继续培养,经 FISH 分析证实为正常女性胚胎 (XX,2121)?678?中华妇产科杂志 2002 年 11 月第 37 卷第 11 期ChinJObstetGynecol,November2O02,Vo1.37,No.II后移植,获得妊娠并分娩一正常健康女婴.另外 l0 广阔 .多年来经 PGD 出生的 400 多名婴儿中未见明显异常,均初步表明了 PGD 的安全性.二,细胞 FISH 在 PGD 中的应用价值本研究中,应用单细胞 FISH 检测对植入前胚胎进行性别诊断或染色体数目诊断
16、都是准确的.例 4中 FISH 诊断的 3 个正常女性胚胎 (XX,2121),移植后足月妊娠出生正常女婴;例 3 中 3 原核多精受精胚胎取 1 个细胞行 FISH 检测,结果为 XXX,212121的胚胎,均验证了 FISH 技术的准确性 .每个胚胎活检取下 2 个单细胞作 FISH,出现相同的结果,可避免出现染色体嵌合型胚胎,减少诊断错误.三,PGD 存在的问题和前景目前,PGD 所需实验仪器及探针昂贵,技术难度大,诊断风险大,所以发展缓慢.但是,随着人们对PGD 的认识和需求的增加,PGD 技术的改善及分子生物学,生物信息学技术的发展,尤其在人类基因组计划完成后明确了基因与疾病发生的关
17、系,将为PGD 应用提供基本的信息,PGD 应用的前景将会很(本文图 16 见插图 111 页)参考文献1 葛秦生,主编.临床生殖内分泌学.北京:科学技术文献出版社 ,2001.646.648.2nandysideAH,DelhantyJD.Ck 丑 vastagebiopsyofhumanembryosanddiagnosisofXchromosomelinkedrecessivedisease.In:EdwardsRG.ed.Preconceptionandpreimplantationdiagnosisofhumangeneticdisease.nd0n:Cambndge.1993.23
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19、humangametesandconceptuaes.NewYork:TheParthenonPublishingGroup,1999.97-99.6GeraedtsJ,HandysideA,HarperJ,eta1.ESHREpreimplantationgeneticdiagnosis(PGD)consortium:preliminaryassessmentofdatafromJanuary1997toSeptember1998.ESHREPGDConsortiumSteeringCommittee.HumReprod,1999,14:31383148.7HandysideAH,Seriv
20、enPN,OgilvieCM.Thefutureofpreimplantationgeneticdiagnosis.HumReprod,1998,13:249-255.(收稿日期:2002-03.12)(本文编辑: 姜民慧)第二次全国抗栓溶栓学术研讨会征文通知由中华医学会中华医学杂志编辑委员会,中华血液学分会血栓与止血学组,中华医学会检验学分会,神经学分会,外科学分会共同举办的全国抗栓溶栓学术研讨会,定于 2003年 3 月在海口召开.现将会议有关事项通知如下.1.征文内容:血栓形成的机制;血栓性疾病相关因素的临床监测;血栓性疾病的实验室检测;血栓性疾病的影像学诊断;血栓性疾病的抗凝溶栓疗法;
21、心脑血管疾病的抗栓溶栓;介入治疗的抗栓溶栓;血管性疾病与外科手术病人的抗凝溶栓;妊娠期凝血及纤溶系统改变;产科 DIC 的病因及肝素应用;血栓性疾病的预防诊断和治疗中存在的问题及防治对策等.2.征文要求:(1) 请寄全文及 1000 字摘要各 1 份(摘要中图表删略,但数据较多可以列表).要求稿件格式同中华.消息.医学杂志(中华医学杂志将为本次会议出版一期增刊);(2)稿件请一律提供打印样及软盘,可通过电子信箱投稿();不符合征文要求者不能收入增刊.自留底稿 ,恕不退还;(3)来稿请加盖公章,附单位介绍信;(4) 截稿日期2002 年 l2 月 10 日,以邮戳为准,延误者不能收入增刊 ;(5)稿件请寄北京东四西大街 42 号中华医学杂志编辑部纪莉莹收,信封注明“抗栓会议“ 字样 ,电话:010-65273362.本次会议为国家级继续教育项目,将授予国家级继续教育学分 8分.希望心血管,血液,神经,呼吸,外科,妇产科及检验医师参加会议共同研讨,以进一步提高血栓性疾病的诊断和治疗水平.(中华医学会中华医学杂志编辑委员会)
