1、血红蛋白的提取与分离,教学目标教学重点教学难点,理解色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理 了解缓冲液的组成及其作用 血红蛋白的分离凝胶色谱法的原理电泳法分离大分子的原理,思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？,选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。,一、基础知识,蛋白质提取与分离的依据蛋白质的物化理性质：,形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别。,（一） 凝胶色谱
2、法（分配色谱法）,1、材料凝胶：,一些微小多孔的球体，内含许多贯穿的通道，多数是由多糖类化合物构成。（如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）,3、原理分子量小的，穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，移动慢。分子量大的，穿过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，移动快；,2、概念根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。,1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。,（二）缓冲溶液,2、作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影响，维持PH基本不变。,3、配制,
3、通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。,由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。 如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等,（三）电泳,1、概念指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,思考：在血红蛋白的提取和分离实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？,使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）,2、原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在( )下，这些基团会带上（ ） 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（ ）
4、移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（ ）以及分子本身（ ）、（ ）的不同使带电分子产生不同的（ ），从而实现样品中各种分子的分离。,正电或负电,所带电荷相反的电极,带电性质的差异,大小,形状,迁移速度,一定的PH,在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。,3、分离方法：4、分离过程：,琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。,为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入( )。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是( )。SDS能与各种
5、蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于( )。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。,SDS,单条肽链的分子量,分子的大小,电泳检测结果,二、实验操作实验步骤,思考 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取。人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。,血液组成成分,阅读思考： 血液由_和_两部分组成。 血细胞中_细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是
6、_。 该化合物是由 _和_构成的，其中每条肽链中都含有一个能与O2和CO2结合的_基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含血红素而呈现红色。,红细胞,血红蛋白,2条-肽链,2条-肽链,亚铁血红素,血液,血浆,水分,固体物质,血浆蛋白,无机盐 磷脂 葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞 （最多）,血红蛋白 （ ）,两个a肽链,两个一肽链,共四条肽链,90,（1）目的：去除（ ） （2）方法：（ ）离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（ ），将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯。再加入用（ ）的（ ）洗涤，低速短时间离心，重
7、复洗涤三次，直至上清液中已没有（ ），表明洗涤干净。,杂质蛋白,低速短时间,黄色血浆,五倍体积,生理盐水,黄色,1.洗 涤 红 细 胞,1.洗 涤 红 细 胞,血液 100mL,重复洗涤3次，直至上清液没有黄色,2.释放血红蛋白,阅读思考： 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？ 为了加速释放过程，采取了什么措施？,目的分析： 蒸馏水的作用是_ 。 加入甲苯的作用是_。 充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,加（ ）到（ ）体积，再加40体积的（ ），置于（ ）上充分搅拌10分钟，细胞破裂释放出血红蛋白.,原血液,甲苯,磁力搅拌器,蒸馏
8、水,磁力搅拌器,搅拌器正在工作,3.分离血红蛋白,分离过程,红细胞 混合液,将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min，试管中的溶液分为4层:,分离血红蛋白溶液,有机溶剂 无色透明的甲苯层,脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层,血红蛋白溶液 红色透明液体,红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物,用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,取( )ml的血红蛋白溶液装入（ ）中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的（ ）中，pH为（ ），透析12小时，目的是（ ）或用于更换样品中的（ ）。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称
9、玻璃纸。,除去样品中分子量较小的杂质,透析袋,磷酸缓冲液,7.0,缓冲液,1,4.透析血红蛋白,利用透析袋透析,纯化凝胶色谱操作,1.凝胶色谱柱的制作：,2.凝胶色谱柱的装填：,教材图519,3.样品的加入和洗脱,1、凝胶色谱柱的制作,取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。,底塞的制作：打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。 a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔； b、在橡皮塞顶部切出锅底状的凹穴，在0.5ml的移液管头部切下5cm长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。,底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实
10、尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。,注意,c.剪尼龙网小圆片覆盖在橡皮塞的凹面上，用100目的尼龙纱将橡皮塞上部包好，插到玻璃管一端。 d、色谱柱下端用移液管头部做出口部位，连接一细的尼龙管，并用螺旋夹控制尼龙管的打开与关闭，另一端放入收集色谱流出液的收集器内,安装其他附属结构。,顶塞的制作：,插入安装了玻璃管的橡皮塞,组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。,凝胶色谱柱填料的处理,（1）凝胶的选择： （ ）（G-75）“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。“75”表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。,（2）方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于（
11、）中充分溶胀后，配成（ ）。,蒸馏水,凝胶悬浮液,交联葡聚糖凝胶,固定：将色谱柱装置固定在支架上,装填：将（ ）一次性的缓慢倒入（ ）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。,2、凝胶色谱柱的装填方法,凝胶悬浮液,色谱柱,注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在( )高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分（ ）12小时。,洗涤平衡,注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最
12、终生物大分子物质的分离效果。 2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。,50cm,装配好的凝胶柱,材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液 装填:,2.凝胶色谱柱的装填：,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,凝胶颗粒洗脱液沸水浴,3、样品加入与洗脱,加样前,打开下端出口，使柱内凝胶面上的（ ）缓慢下降到与（ ）平齐，关闭出口,缓冲液,凝胶面,调整缓冲液面：与凝胶面平齐 滴加透析样品：用（ ）将1ml（ ）
13、的样品加到色谱柱的（ ） 样品渗入凝胶床：（ ） 洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱 收集：待（ ）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（ ）收集一试管连续收集,注意正确的加样操作：不要触及破坏凝胶面 贴壁加样使吸管管口沿管壁环绕移动,吸管,透析液,顶端,样品完全进凝胶层,5ml,红色的蛋白质,加透析样品,开始进行层析,收集得到的纯化后的蛋白,血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,思考,血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的
14、释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（ ）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（ ）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（ ）。,思考,样品的粗分离,纯化,纯度鉴定,注意事项,1. 红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 2. 凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡 3. 色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 4. 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。,纯度鉴定SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,判断（ ）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。,纯化,3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电
15、泳鉴定血红蛋白纯度,（1）试剂的配制,丙烯酰胺和N, N-亚甲基双丙烯酰胺 用去离子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N, N-亚甲基双丙烯酰胺的贮存液,十二烷基硫酸钠（SDS） 用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存。,用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液, 用去离子水配制10% 过硫酸铵作用提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。, Tris甘氨酸电泳缓冲液 25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%的SDS。, 样品处理液 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)，100 m
16、mol/L DTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。, 染色液 0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸 脱色液 10%的甲醇和10%的冰醋酸。, SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备,1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板,2）SDS聚丙烯酰胺凝胶制备,用去离子水4.6 mL，30%的丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8的Tris缓冲液2.5 mL，10%的SDS 0.1 mL，10%的过硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5 cm
17、)，再在胶液面上小心注入一层水（约高23 mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。,（2）电泳方法步骤,配制SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。用去离子水2.7 mL，30%的丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8的Tris缓冲液0.5 mL，10%的SDS0.041 mL，10%的过硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。,分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。,3
18、）样品处理,5)加样,在电泳样品中按11体积比加入样品处理液，在100 温度下加热3 min，以使蛋白质变性。,按顺序加样，加样量通常为1025 L。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品,4）浓缩胶聚合完全后（30 min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。,7）剥胶,从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。,8）染色,将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1-2 h。,6)电泳 将电
19、泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm处，关闭电源。,10)观察结果：,SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。,9)脱色： 染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色3-10 h，其间需多次更换脱色液至背景清楚。,观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,三 实验结果
20、分析与评价,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,讨论：如何测定蛋白质的分子量？,使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售,知识总结,血红蛋白的提取和分离,
