1、甘油对毕赤酵母高密度发酵表达重组水蛭素的影响中圈粟科久擎JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2006,37(4):371374371甘油对毕赤酵母高密度发酵表达重组水蛭素的影响宋留君.,周长林,窦洁.,林健(中国药科大学生命科学与技术学院,南京 210009;上海美通生物科技有限公司 ,上海 200235)摘要目的:考察甘油对毕赤酵母生长和重组水蛭素 表达的影响.方法: 在摇瓶和10L 发酵罐中用含有不同浓度甘油的培养基培养毕赤酵母,测定毕赤酵母的生长和重组水蛭素的表达.结果:发酵培养基中初始甘油浓度为 5L 时,毕赤酵母生长速度明显加快;补料过程中甘油
2、浓度大于 7OL 时,毕赤酵母生长受到抑制.与不加甘油相比较,诱导表达期维持培养基中甘油浓度在 5g/L 以下,重组水蛭素表达可提前 4h,诱导 30h 其活性达 13000ATu/止,比仅用甲醇诱导时效价提高了 7.7%.结论:降低初始培养基中甘油浓度有利于毕赤酵母生长 ,补料过程中培养基甘油浓度应维持在抑制毕赤酵母生长的浓度之下,诱导阶段培养基中少量的甘油有利于水蛭素的表达关键词重组水蛭素;毕赤酵母;甘油中图分类号 Q815 文献标识码 A 文章编号 lOOO 一 5048(2006)04037104Effectsofglycerolonrecombinanthirudin11expres
3、sioninhighdensityfermentationbyPichiapastorisSONGLiu.jun,ZHOUChang.1in.,DOUJie.,LINJian2SchoolofLifScienceTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009;.喇 GeneralScie,BiotechnologyCo.,Izd.Shanghai200235,ChinaAbstractAim:ToinvestigatetheeffectsofglycerolonPichiapastorisgrowthandrecombinanthi
4、mdin11(HirII)expression.Methods:Pichiapastoriswasculturedinthemediumcontainingdifferentconcentrationsofglycerolinflasksand10Lfermentor.CelldensityandHirIIactivityweredetected.Results:CellgrowthWasinereasedobviouslyat5g/Lglycerolintheinitialmediumandinhibitedatglycerolof70g/L 印glycerolWasmaintainedle
5、ssthan5g/Latinductionphase.HirIIexpressionWasfoundtobeaccomplished4hoursearlierthanthatwithoutadditionofglycero1.and30.hourinductionresultedinHirIIof13000ATU/mLwhichWasonlyincreasedby7.7%ofcomparedtothatfollowingmethanolinduction.Conclusion:Lowglycerolconcentration(5g/L)atlagphaseandinductionphaseis
6、helpfulforPichiapastorisgrowthandHirIIexpression,andfedbatchglycerolshouldbekeptunderinhibitedconcentrationof70g/L.Keywordsrecombinanthimdin:P/apastor/s:glycerol水蛭素(HirII) 是一种含 6566 个氨基酸残基的无糖基化多肽,相对分子质量为 7000 左右,是目前对凝血酶活性抑制作用最强的物质.天然水蛭素存在于水蛭的头部,含量很低,无法满足医疗需求.重组水蛭素目前已经成功在大肠杆菌,链霉菌,酵母,枯草杆菌和转基因烟草中表达.毕赤酵
7、母具有可在以甲醇为唯一碳源的培养基中生长,易达到较高的细胞密度,产物分泌表达且效率高以及遗传稳定等优点_2j,是生产重组水蛭素应用最多的表达系统.本实验旨在研究甘油对毕赤酵母高密度发酵生产水蛭素的影响.考察了初始发酵培养基中甘油对毕赤酵母生长的影响补料过程和甲醇诱导阶段甘油对水蛭素表达的影响.1 材料和方法1.1 试剂和仪器纤维蛋白原(上海莱士血制品有限公司);凝血收稿日期 20060104 通讯作者 Tel:02583271323E-mail:372 中圃喜科太警 JourndofChinaPharmaceuticalUniversity 第 37 卷酶(湖南一格制药有限公司);酵母氮源(Y
8、NB,北京经科化学试剂公司,Difco 分装); 甘油三酯(TG)测定试剂盒(浙江东欧生物工程有限公司);其他试剂均为国产分析纯.BiostatC.10 发酵罐(德国 B.BraunBiotechIntemational 公司 );752 分光光度计( 上海分析仪器三厂).1.2 菌种毕赤酵母 GS115/HV2 由上海美通生物科技有限公司提供.1.3 培养基培养基配方组成见文献3.1.4 高密度培养和表达将基因工程菌毕赤酵母 GS115 从斜面上接种至装有 50mLMGY 培养基的 500mL 三角瓶中,30oC,200r/min 培养 30h,使 A6oo 达到 12.5,作为种子液.摇瓶
9、和发酵罐发酵均以 3%接种.摇瓶培养毕赤酵母的条件为 30oC,200r/min;发酵罐发酵中,通气量开始为 4L/min,8h 后升为 7L/min,转速自动调控,30培养,溶氧 30%.在考察甘油浓度对抑制细胞生长的实验中,将毕赤酵母 30oC,200r/min 培养一段时间,甘油耗尽后将各瓶合并后再分装,添加甘油至不同浓度.在考查诱导阶段甘油最佳浓度的实验中,诱导前各组发酵培养基完全相同(甘油含量为 40L),培养至甘油耗尽,以 3g/L 的量补加甲醇诱导,同时补加甘油至不同浓度,30,200r/min 培养 96h,将发酵液离心,测定上清液活性.1.5 生长曲线的绘制用 752 分光光
10、度计测定 A6oo.每 3h 取发酵液2mL,分装于两个 1mL 离心管,10000r/min 离心 5min,将上清倒去,吸干残留液体,称重.将所得数值减去离心管的重量,两管菌体重量的平均值即为湿重(WCW,g/L).1.6 甘油浓度测定按试剂盒说明书测定甘油含量.1.7 水蛭素活性测定_4根据发酵液活性高低,用 Tris.HC1 缓冲液将发酵液稀释不同倍数,取 50 止加入滴定板孔中,再加入 0.5%的牛血纤维蛋白原 200/_tL.每次加入50u/rl1L 凝血酶溶液 10,在 1min 内观察凝结情况,若出现凝结即达到终点,记下加入凝血酶溶液的次数(n).水蛭素与凝血酶按 1:1 反应
11、,由凝血酶的消耗量(出现沉淀前加入凝血酶的量),计算出水蛭素的抗凝血酶活力单位(ATU).发酵上清液抗凝活力(删 mL)=2 实验结果2.1 初始培养基中甘油浓度对生长的影响摇瓶培养 8 和 16h,600 随初始培养基中甘油浓度的增大呈递减趋势.随着时间延长,初始培养基中甘油浓度小的摇瓶因甘油耗尽而生长减缓,初始甘油浓度较大的摇瓶则因甘油消耗到合适浓度而生长加快,28h 甘油浓度为 30L 的摇瓶 A6oo 最大,说明甘油浓度较低有利于毕赤酵母生长.不同甘油浓度下培养 8,16,28h 测得的吸收度见图 1.l284O5lO2O3O4O5O6O7O8O.lg?L-1)口 8h 豳 16h 目
12、 28hFig.1Effectofglycerolconcentrationoncellgrowthinflasks为了进一步验证这一结果,选择初始培养基中甘油浓度分别为 5g/L 和 40g/L 两种条件,在发酵罐中进行高密度培养.甘油浓度为 5L,培养至 15h 溶氧开始上升,培养基中甘油耗尽,开始补料.此时 Am0为 15.3,湿重为 30.3g/L.,此后生物量快速增加,27h,Am0 为 76.9,湿重为 193.5L,继续培养至 45h 湿重达到 445g/L.甘油浓度为 40L,30h 甘油耗尽,开始补料,此时 Am0 为 37.5,湿重为 83.5L,培养至 54h湿重达到 3
13、14g/L(13 图 2 所示).l2O90603OO250200150100 言5OO0369l2l5l82l24273Ot/h一_一 A(4og/Lglycero1);一口一 WCW(4og/Lglycero1);一一 A(5g/Lglycero1);一一 WCW(5g/Lglycero1).2Effectofglyceroloncellgrowthin10Lfennentor第 4 期宋留君等:甘油对毕赤酵母高密度发酵表达重组水蛭素 的影响 373实验证明,减小初始培养基中甘油浓度(由 4og/L 减小至 5g/L),甘油会较快耗尽,补料时间提前,对补料前的生长阶段有利.因此如能在补料过
14、程中控制适当的甘油浓度,则能够缩短发酵时间,提高菌体密度.2.2 抑制毕赤酵母生长的甘油浓度考察抑制细胞生长的甘油浓度摇瓶实验中,分装后培养 6h 测 A60o,不同甘油浓度下酵母的生长情况如图 3.可以看出,当甘油浓度达到 60L 时生长受到抑制,7OL 时有较明显的抑制作用.1816毫1412r.几 f_51020304050607O80幽/(g?L-L)rag?3Effectofglyceroloncellgrowthinflasks分批补料发酵中,流加甘油,每小时测发酵液中甘油浓度,并测 A6o0 和湿重.结果显示,当发酵液中积累的甘油浓度达到 70L 时,毕赤酵母生长速度明显放慢.所
15、以发酵过程中培养基中的甘油应该控制在 70L 以下.2.3 甘油对水蛭素表达的影响在毕赤酵母表达外源基因期间,一方面需要能量维持细胞生长和代谢,另一方面需要能量表达外源蛋白.为满足对能量的需求,只有增加碳源的供给,但甲醇浓度过高会对毕赤酵母产生毒性【53.虽然甘油能抑制醇氧化酶(AOX1)的活性,但许多实验证明在诱导过程中流加一定量的甘油能促进外源蛋白表达 5-7.诱导过程中甘油要保持在一定浓度才能起到促进外源基因表达的效果.摇瓶实验诱导阶段,向摇瓶中加人甘油,使其浓度分别为 0,5,10,20,30,4o,5O,60L.每 24h 补加甲醇 200p.L,诱导 96h.在甘油浓度为 5L 时
16、发酵液活性最高.当甘油浓度大于 20L 时,发酵液中检测不到活性.甘油对诱导阶段毕赤酵母的生长有一定促进作用,培养基中甘油浓度为 3OL 的摇瓶 A6oo 最大,如图 4所示.200-.d150宅 100:三 500.星,.目虽.目.目.目 051020园 Activity30405060目啦.4EffectofconcentrationofglyceroloncellandHirudinexpressioninflasks本实验中甘油流加速率在 0.10.2mE/(L?min)之间,每 2h 测定培养基中甘油浓度,使其保持在 5L 以下.诱导开始阶段生物量有所增加,诱导过程中湿重基本维持在
17、500g/L 左右.47h开始出现活性,比仅用甲醇诱导提前 4h.此后活性快速增加,75h 发酵液活性达到 13000ATU/nlL(见表 1),比仅用甲醇诱导活性提高 7.7%,此后生物量和发酵液活性都开始下降.在甲醇诱导过程不流加甘油的补料分批发酵中,诱导开始的一段时间内生物量有所下降,4575h 内活性增加速度较慢,75h 发酵液活性达到 12000ATU/nlL,但诱导至90h 发酵液上清可达到 20000ATU/IllL(见表 1).图 5 比较了诱导阶段仅流加甲醇和甲醇一甘油混合流加两种情况在 4575h 内的细胞湿重和发酵液活性.Tab.1Concentrationofglyce
18、rol,WCWandactivityofHimdin1Iinfedbatchfermentation374 中圃兽科太擎 Journa/ofChinaPharmaceuticalUmvers第 37 卷600.-400;200U0455l57636975t/h15000一l0000350000一一 wwT(withglycero1);一一 wwT(witl 叫 tglycero1);一一 Activily(withglycero1);一一 Activity(witl 叫 tglycero1)Fig.5CellconcentrationandHirudin11activityininductio
19、nphase3 讨论无机盐发酵培养基中的甘油浓度为 40g/L_8J,实验证明在摇瓶和发酵罐中初始培养基中甘油浓度降低至 5g/L,待甘油耗尽后及时补料,能很大程度上缩短毕赤酵母延滞期,促进毕赤酵母生长.补料分批发酵,培养基中甘油积累到一定程度会造成底物反馈抑制,使毕赤酵母生长速度放慢甚至停止生长,所以在流加过程中要控制甘油补加速度,使培养基中甘油浓度在限制性浓度以下.可以根据溶氧的变化,通过调节补料速度控制甘油浓度,本实验中用甘油三酯检测试剂盒能够准确地测定甘油浓度,通过调节补料速度较好地控制了培养基中残留甘油浓度.此外,甘油浓度的检测还可以使用高碘酸钠滴定法J.甘油会抑制 AOX1 的活性
20、,但有报道称在诱导过程中流加少量甘油可以促进产物表达.谢静莉等11用毕赤酵母表达血管生成素的研究中,证明同时流加甘油和甲醇有利于产物生成.马善康等12用甘油和甲醇交替流加,促进人尿激酶的高效表达.Filesa 等_6J 在用毕赤酵母发酵生产半胱氨酸蛋白酶抑制剂一 C 的实验中也证明甲醇诱导时流加甘油能使产量提高.本实验在流加甲醇诱导的同时,以 0.10.2mIJ(L?min) 的速度流加 5O%的甘油,使其保持在 5g/L 以下.和诱导过程中仅流加甲醇相比,诱导初始阶段生物量有所增加,并且整个诱导阶段生物量基本保持在 500g/L 左右,发酵 75h 内发酵液活性增长较快.但 75h 后发酵液
21、活性和生物量均开始下降,发酵液最终活性只有13000ATU/mL,而单纯用甲醇发酵 90h 活性可达20000ATU/mL,这是否由甘油所致需进一步实验证明.参考文献1周祥山(ZhouXS),周卫斌 (ZhonWB),范卫民(FanWM),等.重组毕赤酵母高密度发酵表达水蛭素过程中产物的生成和降解J.中国生物制品学杂志(ChinJBotog/cats),2003,16(1):2427.2JahicM,WallbergF,BollokM,a/.TemperaturelimitedfedbatchtechniqueforcontrolofproteolysisinP/ch/apastor/sbioreactorcuhuresJ/OL.(20036-18)2OO51221.http:/
