1、6 转基因动物,转基因动物是动物基因工程在医学生物学研究中的突出成果。近十年来，为分子遗传学、发育生物学、医学遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的开发研究等多方面做出了很大的贡献。,一、转基因动物的概念转基因动物(transgenic animal)是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。,严格说，转基因动物有别于嵌合体。,嵌合体动物:chimeric animal只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因。逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法制备的动物第一代均为嵌合体。雄原核显微注射法制备的动物第一代中1-10%为嵌合体（延迟整合）。,Chimera：来源于一
2、个以上的受精卵 Mosaic：来源于同一个受精卵,二、转基因动物的发展历史,1974年 首次转基因小鼠1980年 首次转人类基因小鼠1982 年 Palmiter 等运用此法得到的所谓“超级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。,转大鼠生长激素基因的 “超级”小鼠,到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、牛等等大小动物。从转基因动物所获得的资料几乎涉及医学遗传、肿瘤学、免疫学等的基因研究，还涉及生物药物的研究，基因治疗的开发研究等。,世界首只转基因 猴,无父双母小鼠,世界上首匹“自体克隆马”,“连连”、“田田”和“云云”,携带鸡IBDV基因的 转基因绵羊,携带人mAAT蛋白基因的转基因山羊
3、,“不传播疟疾”的转基因蚊子,三、动物转基因的方法,1、受精卵雄原核显微注射法 2、胚胎干细胞（ES细胞）法 3、逆转录病毒感染法 4、体细胞核移植法 5、精子载体法 6、YAC法,1、雄原核显微注射法 以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入代孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。 目前应用较广泛, 最早最经典的方法,这一方法的实验程序如下： 准备代孕母鼠（养母） 受精卵的准备 基因导入 胚胎移植 对幼鼠的鉴定,其成功率的高低主要取决于受精卵和胚胎发育的时间。基因的整合是随机的，多数插入单一染色体位点中。外源基因的插入会引
4、起宿主基因的DNA序列重排，缺失，重复或易位。,外源基因也可不插入呈游离状态，以质粒形式存在表达功能并传给子代。其详细机理现在也不是很清楚。,优点：外源DNA大小基本不受限制(1-50kb) 导入过程直观整合率高,缺点：设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求 低效率（尤其是大家畜） 对卵细胞伤害大，胚胎存活率低基因整合随机性转基因沉默,2、胚胎干细胞（ES细胞）法 ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。,它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织
5、，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。,在ES细胞上的基因操作：可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源基因导入ES细胞。,因此，借用ES 细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到ES 细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因功能的动物后代。,胚胎干细胞法获得转基因鼠,Generating ES Cells,优点：外源基因整合情况的可控性高。 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便。,缺点： ES细胞系建立及培养困难。 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易
6、。 所得个体为嵌合体,目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。,3、逆转录病毒感染法 将目的基因重组到逆转录病毒（LTR）载体上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的）, 获得转基因动物的方法。 P123图6-2,优点：受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵细胞的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高,缺点： 潜在的致癌性 载体构建较复杂 容纳大小有限 整合率不高 重组逆转录病毒不稳定，可能干扰外源基因的表达 胚胎的自我保护机制对其有抗性
7、,4、体细胞核移植法 将外源基因导入到体细胞中，再将该细胞进行培养，选择其中带有外源基因的细胞进行扩增，用这种细胞的细胞核进行核移植（把体细胞核植入一个去了核的未受精卵中，融合并激活），将重组胚进行体外培养或者植入同步化的代孕动物的输卵管。,在理论上应该全部为阳性转基因动物，而且外源基因的表达稳定，外源基因的整合率可达100%。,1997年，英国：Wilmut等的克隆羊Dolly 1999年, 中国陈大元：利用兔的卵母细胞获得种间核移植的大熊猫胚胎 2000年，美国：转基因牛,世界首只克隆羊多莉,转人基因公牛与它的孩子们,优点：转基因的效率高，不仅具有“ES细胞途径”的全部优点，且物种适用面广
8、，无需经过嵌合体育种就可获得纯合个体，周期短，效率高。,缺点：技术上难度。成功率极低。胚胎死亡率高。非一般实验室可以开展。,5、精子载体法 直接以精子为载体的转基因方法。 先将成熟精子与外源共培养后，再将成熟的精子与外源DNA进行预培养，使精子有能力携带外源DNA进入卵子中，使之受精，并使外源DNA整合到染色体中。,优点：注射针口径 大100倍 能处理兆及亚兆碱基级的基因构建 提高外源基因的整合及表达水平,缺点：实验结果不稳定重复性差,6、法 利用酵母人工染色体()作为载体获得转基因动物的方法。 酵母人工染色体（）载体是近年来发展起来的新型载体, 能克隆百万对碱基的大片段。,优点： 保证大片段
9、的完整性 。 保证较长外源片段在转基因动物研究中的整合率提高 。 保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性，因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。,因此介导法制备转基因动物具有广阔的应用前景。畸胎瘤细胞介导法，高效微弹法等方法都不太成熟，应用也较少。,四、转基因动物的检测,分子杂交 斑点杂交 聚合酶链式反应(PCR) 原位杂交,五、转基因动物的特性,整合拷贝数1-100左右，多拷贝常以首尾相连接的形式存在。 整合是随机的。 整合是稳定的，可以传给子代。 外源基因可以在一种组织或多种组织中表达。 少数外源基因两侧序列有重排现象。 基因表达强弱与拷贝数无关，与“位置效应”有关。,六、转基因动物的意
10、义,1. 转基因动物模型与基因治疗 2. 优良动物品种育种a. 快速生长与肉质改良b. 增强抗病性，抗冻性 3. 医药领域的应用a. 抗出血药物 b. 抗凝血药物c. 血栓治疗药物d. 肺气肿治疗药物e. 免疫治疗药物f. 人型化单克隆抗体 4. 在异种器官移植中的应用,七、转基因动物的应用,1、在基因功能等研究中的应用 2、在动物育种中的应用 抗病 加快生长 提高产毛能力和改善乳品品质 提高动物的生存能力 3、在医学中的应用 生产用于人体器官移植的动物器官 开发新药 作为人类疾病模型 作为生物反应器的应用,转基因猪,转基因猪的特点,生长速度快,瘦肉多,饲料消耗少,转基因鱼,不能生育的转基因鱼
11、,转生长激素基因 鲤鱼，比普通鱼 生长快42%,142 天平均体重648g， 经济效益125%。,转基因观赏鱼,曹谊林,器官培养人耳,转基因牛乳腺生物反应器的制备流程,转基因羊,羊受精卵,凝血因子基因,代母亲,乳汁含治疗血友病的凝血因子,将基因注入受精卵,带有人凝血因子基因的转基因羊 (1998),羊奶可治血友病,六、转基因动物研究出现的问题,1、制作转基因动物效率低2、外源基因在宿主基因组中的行为难以控制 3、转基因表达水平4、安全性问题5、传统观念与伦理的挑战,1、制作转基因动物效率低 这是制约这项技术广泛应用的关键。以显微注射法生产转基因动物为例，小鼠、大鼠、兔、牛、猪、绵羊转基因阳性率
12、分别为26%、44%、15%、0.7%、0.9%、0.9%。,2、基因在宿主基因组中的行为难以控制 转基因随机整合于动物的基因组中，很有 可能引起宿主细胞染色体的插入突变，还可造 成插入位点的基因片段的丢失及插入位点的基 因的位移，同时也可能激活正常情况下处于关 闭的基因。其结果导致转基因阳性个体出现不 育、胚胎死亡、流产、畸形等异常现象。,3、转基因表达水平低 许多转基因的表达水平受到宿主染 色体上整合位点的影响，往往出现异位 表达，影响转基因的表达能力，从而使 大部分转基因表达水平较低，极少部分 表达水平过高。,4、安全性问题 5、传统观念与伦理的挑战可以克隆人吗？！,THANK YOU!,
