1、钙调蛋白在氟中毒大鼠肝组织中的表达中国地方病防治杂志 2008 年第 23 卷第 3 期 ChinJCtrlEndemDisVo1.23No.钙调蛋白在氟中毒大鼠肝组织中的表达吕学霞,于燕妮,陈杨,万昌武,张华,官志忠?165?【摘要】目的探讨钙调蛋白在氟中毒大鼠肝组织中的表达及意义.方法在饮水中加入氟化钠进行大鼠染毒试验,3 个月后采用免疫组化技术及 RTPCR 技术检测大鼠肝脏中钙调蛋白(CaM)的表达水平 .结果与对照组相比,染氟浓度为 25ms/L,50ms/L,100ms/L 组大鼠肝脏 CaMmRNA 及蛋白表达水平均增高,并随染氟浓度的增加,表达增强.结论氟可以导致大鼠肝脏 Ca
2、MmRNA 及蛋白表达水平增强 .【关键词】钙调蛋白;氟中毒;免疫组化;RTPCR中图分类号:R516.8 文献标识码:A 文章编号:10011889(2008)03016503ExpressionofcalmodulininhepatocytesofratswithfluorosisLVXuexia,YUYanni,CHENYang,etall(DepartmentofPathology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004)【Abstract】ObjectiveToinvestigatethemeaningofcalmodulininhepatocytes
3、ofratswithfluorosis.MethodsExperimentalWistarratswereexposedtosodiumfluoride(NaF)addedtodrinkingwater,.ExpressionofbothmRNAandproteinofcalmodulininratlivertissueweredeterminedbyRTPCRandinununohistochemistryafterthreemonthexperimentalperiod.ResultsTheresultsshowedthattheexpressionof,almoduhnmRNAandpr
4、oteininthosegroupstreatedwithfluoride(concerttrationsof25mS/L-50ms/Land100ms/L)wereincreased.Andthehighertheconcentrationwas,thehighertheexpressionlevelWas.ConclusionsFluorideCanleadtothehighexpressionofcalmodulinmRNAandproteinintheratlivertissueex-posedtosodiumfluoride.【Keywords】 Calmodulin;Fluorid
5、epoisoning;Immunohistochemistry;RTPCR随着对氟中毒研究的深入,越来越多的研究开始探讨氟中毒相关基因的变化,以期从分水平研究氟中毒的发病机制.在研究细胞凋亡中发现,氟是很有效的 G 一蛋白调控的信号转导通路的活化剂.因此,许多人将对氟中毒发病机制的研究转向信号转导方面.钙调蛋白是胞内重要的 Ca“的受体蛋白,介导调控由 Ca“引起的一系列生理生化反应,参与调节细胞的增生,分化,运动等活动,在细胞的信号转导中起着非常重要的作用.本研究拟通过饮水加氟复制氟中毒大鼠模型,观察大鼠肝脏钙调蛋白表达的变化,并探讨其在氟中毒发病机制中的意义.1 材料与方法1.1 主要试剂
6、兔抗鼠 CaM 多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司),兔 EnVision 二步法免疫组化试剂盒(北京中杉金课题来源:贵州省国际科技合作重点项目,编号:黔科合外 G 字(2007)400119 号国家重点基础研究发展计划(973 计划)课题,黔科合重大专项字f200660l5.作者单位:贵阳医学院病理教研室(贵州 550004)作者简介:吕学霞(1981 一),女,河南新乡人,硕士在读,主要从事地方病病理研究.通讯作者:于燕妮 .桥生物技术有限公司),总 RNA 提取试剂盒(天根生化科技有限公司),逆转录试剂盒(fermentas 公司).1.2 氟中毒模型的建立及标本制备由贵阳医学院实验动物
7、中心提供的体重 80100g 健康 Wistar 大鼠 64 只,观察 1 周适应环境后,随机分为 4 组,每组 16 只,雌雄各半,分别为对照组,低氟组,中氟组,高氟组;其中对照组大鼠自由饮用自来水 ;低,中,高氟组大鼠分别饮用含氟 25mg/L,50mg/L,100mg/L 的水.实验周期为 3 个月.大鼠染氟满 3个月后,置不锈钢代谢笼中收集 24h 尿,供测定尿氟用.股动脉放血处死大鼠,取肝组织适量用福尔马林固定,供 HE 切片及免疫组化用,其余肝组织一 70冰箱低温保存,供提取 RNA 用.1.3 实验方法1.3.1 尿氟测定采用氟离子电极法.1.3.2 免疫组化检测肝脏钙调蛋白的表
8、达严格按照免疫组化试剂盒 EnVision 二步法说明书进行, 兔抗鼠 CaM 多克隆抗体稀释浓度为 1:70,以胞浆或胞核着色为染色阳性细胞.免疫组化结果根据染色阳性细胞数和染色强度分别评分.以随机 5 个 400 倍视野阳性细胞数所占百分比打分:0 分为阳性细胞数5%,1 分为阳性细胞数占 6%25%,2 分为阳性细胞数占 26%50%,3 分为阳性细胞数占 5l%75%,4 分为阳性细胞数75%;染色强度:0 分无染?166?色,1 分淡黄色,2 分黄色,3 分棕黄色.1 分为阳性,1 分为阴性.中国地方病防治杂志 2008 年第 23 卷第 3 期 ChinJCtrlEndemDisV
9、o1.23No.32008两者乘积2.2 大鼠肝组织 CaM 表达水平1.3.3RTPCR 检测肝脏钙调蛋白的表达1.3.3.1RNA 提取严格按照组织总 RNA 提取试剂盒 Trizol 法说明书进行,RNA 提取后经紫外分光光度计检测,A260/A280 均在 1.82.0 之间,琼脂糖凝胶电泳显示,见 28SrRNA 和 18SrRNA 两条带,提示RNA 未降解.1.3.3.2RNA 逆转录成 cDNA 各组 RNA 进行定量后,计算各组加入等量的 RNA(0.15g),按 Fer-mentas 逆转录说明书进行逆转录.1.3.3.3 以 cDNA 为模板进行 PCR 反应采用 25体
10、系,反应条件:95预变性 6min;95变性 30s;退火温度设定为 60,40s;72延伸 40s,30 个循环;727min 终止反应.PCR 产物于 1.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶系统成像并拍照,半定量分析,CaMmRNA 相对表达量以同一体系中目的基因产物电泳条带密度指数与内参照 Bactin 电泳条带密度指数的比值来表示.CaM 基因引物序列如下:sense 链:5 一 GGCATCCTGC1TITAGCCTGAG 一 3antisense 链:5 一 ACATGCTATCCCTCTCGTGTGAC 一 3,产物为 328 院 bp.Bactin 序列为 :sense 链:5 一 TG
11、GAGAAAATCT-GGCACCAC 一 3antisense 链:5 一 GAGGCGTACAGGGATAGCAC一3,产物长度 190bp.1.4 统计学处理所有数据的统计均在 SPSS13.0 软件上进行,均数比较采用 t 检验及方差分析,率的比较采用卡方检验,计量资料采用 xs 表示,以 P0.05 为差别有显着意义.2 结果2.1 氟中毒模型复制成功的结果用氟离子选择电极法测定各组大鼠尿氟,各实验组大鼠尿氟含量均高于对照组,差别有显着性(P0.05),见表 1,说明氟中毒模型复制成功.表 1 不同浓度氟组大鼠尿氟含量(mg/L)注:与对照组比较 P0.05.P0.01.免疫组化结果
12、显示,低,中,高氟组大鼠肝脏 CaM表达阳性率分别为 38.4%,42.8%,68.3%,随着染氟浓度的增加,表达增强.正常对照组大鼠肝脏 CaM 表达阳性率为 16.4%,各氟组大鼠肝组织中 CaM 表达阳性率均高于对照组,差别有统计学意义(P0.05),见表 2,图 1.表 2 各染氟组大鼠肝组织中 CaM 的表达图 1 肝脏钙调蛋白免疫组化结果,a(100),b(400)2.3 大鼠肝组织中 CaMmRNA 表达RTPCR 检测结果显示, 低,中,高氟组大鼠肝组织中 CaMmRNA 表达均较对照组明显增高,差别有显着性(P0.05).各试验组之间相比,大鼠肝组织中 CaMmRNA 表达随
13、染氟浓度的增加而增强.见表3,图 2.表 3 肝组织 CaM 基因(CaM/8 一 actin)灰度值比较(x5)注:与对照组相比,P0.05.3 讨论近年研究发现,氟中毒不仅引起氟骨症和氟斑牙,而且还会造成全身非骨相系统,即骨和牙齿以外的全身各器官与组织的广泛损伤.肝脏是机体新陈代谢和解毒的重要器官,过量的氟进入体内会对肝脏产生毒性作用.流行病学调查发现,地方性氟中毒病区人群的膳食普遍存在低钙,提示钙营养不良可以加重氟对中国地方病防治杂志 2008 年第 23 卷第 3 期 ChinJCtrlEndemDisVo1.23No.32008CaMB-actin图 2CaM 及 BactinmRN
14、ARTPCR 产物电泳图(左起第一泳道为 Marker,二,三,四,五泳道依次为对照组,低氟,中氟,高氟组的 CaM 及 BactinmRNARTPCR 产物,长度分别为 328bp 及190bp).机体的毒性,低钙是地方性氟中毒的主要促发和加重因素.氟可以通过与血清钙直接结合,激活成骨细胞导致对钙离子的需求增加以及减慢骨释放钙离子速度等方式来影响钙的正常代谢,从而使机体钙缺乏;而低钙又可以促进肠道对氟的吸收而加重氟中毒,所以说过量氟和低钙对机体的损伤具有协同作用.研究表明,氟化物可以影响 G 蛋白信号转导通路.G 蛋白信号通路是由 G 蛋白,G 蛋白偶联受体和腺苷酸环化酶(AC)三部分组成.
15、当氟与细胞受体结合后,通过膜内 G 蛋白的转导作用,改变了膜内侧靶酶 AC 的活性,调节第二信使 CAMP 和 ca的生成.第二信使可进一步作用转导氟对细胞的损伤.另外,已有研究证明自由基及氧化应激在氟中毒发病机制中起着重要的作用,且自由基可作为信号转导分子转导胞外信号,影响胞内 Can 浓度.因此,提出过量氟可能是通过各种不同的信号转导途径影响机体代谢.Ca是胞内重要的第二信使,在信号转导中起着重要的作用.当细胞受刺激时,质膜上的 Ca通道会开放,或者胞内 ca 储库同时释放 ca,使胞浆 ca“浓度迅速升高,从而引起动作电位冲动的发生.钙调蛋白是重要的胞内 ca“的受体蛋白,是细胞内=信号
16、传导途径中主要的信号转导分子,CaM 只有在结合Ca之后,即在 Ca“一 CaM 复合物时才具有生物活性.Ca 通过与 CaM 及钙调蛋白结合蛋白的相继作用,转导胞外信号.因此,体内 CaM 水平的变化与机体内 Ca“的变化是密切相关的.CaM 也是调节钙泵的主要因素.Broke_6 的试验结果显示 ,大鼠染氟 6周后,细胞膜钙泵和内质网钙泵的活力减低,细胞内的Ca“浓度增高 .李广生等提出慢性氟中毒存在细胞钙内流增多而导致的细胞钙超载现象.因此,有人推测氟中毒时细胞内 Ca浓度变化在氟中毒发病机制中起着重要的作用.那么研究作为?167?ca受体的 CaM 在机体的表达也具有了重要的意义.但是
17、,目前对于氟中毒时机体内 CaM 表达的变化情况的研究还少有报道.本室前期的研究已发现,氟中毒可以导致体外培养的成骨细胞 CaM 表达增强,已经从细胞水平证实了氟中毒与 CaM 表达的相关关系.为进一步从活体研究氟中毒时机体 CaM 的表达情况,探索氟中毒与信号转导的关系,本实验测定不同浓度氟组大鼠肝脏 CaM 表达情况,结果发现 25,50,100mg/L 氟组 CaM 表达均高于对照组,在活体水平上氟显示出对 CaM 的 mRNA 表达水平及蛋白表达水平的同向促进作用,与前期细胞水平研究结果一致.而且显示出随染氟浓度的增高,表达增强的趋势.我们知道,信息传递过程中需要第二信使,氟中毒时细胞
18、的钙超载现象及 CaM 的高表达提示 CaM 被激活,结合 Ca形成 Ca一 CaM 复合物,引起相应靶蛋白或靶酶构象的改变.它可能是作为信号转导通路中重要的一环来传递氟对机体的损伤作用.由此推测,氟进入机体后,可以作为信号分子或者通过一定途径引起其他信号分子作用于细胞,影响第二信使及相关分子的水平,使相应的蛋白或酶表达发生变化,介导氟对机体的损伤作用.Ca 一 CaM 信号转导途径是机体内重要的信号转导途径之一,CaM 在不同浓度氟中毒大鼠肝脏的高表达提示该途径或与 CaM 相关的信号转导途径可能在氟中毒的发病中起着重要的作用,具体作用机制还有待进一步研究.参考文献1于燕妮,曹序茂 ,肖开棋
19、,等.氟中毒大鼠肝脏损伤的形态计量学研究J.中国地方病学杂志,1990,9(1):13.2孙大业,郭艳林 ,马力耕,等.细胞信号转导M.第 3版.北京:科学出版社,2001,92118.3李广生,张文岚 ,华坤,等.地氟病属“钙矛盾疾病“J.矿物岩石地球化学通报,2003,22(2):93 95.4BigayJ,DeterreP,PfisterC,eta1.FluoridecomplexesofaluminiumorberylliumactonGproteinsasreversiblyboundanaloguesofthegammaphosphateofGTPJ.EM-BOJ,1987,6(10):29072913.5赵美琳,徐启红 .CaM 的特性与研究方法探讨J.四川职业技术学院,2005,15(2):93 94.6BorkeJL.WhitfordGM.Chronicfluorideingestiondecreases45CauptakebyratkidneymembranesJ.JNutr,1999,129:12091213.7王允芹,汤亲青 ,于燕妮.染氟大鼠成骨细胞内钙调蛋白表达的变化J.中国地方病防治杂志.2007,22(5):333336.(收稿日期:20071228)(编辑朱岱)
