1、,真菌感染与实验室诊断进展,真菌感染与实验室诊断进展,北京大学第一医院 北京大学真菌和真菌病研究中心 李若瑜,真菌感染的流行特点,免疫受损,宿主防御部,细胞生长抑制剂,使用抗菌素,静脉插管,微生物,条件致病菌,嗨 Bud!,嗨 伙计!,机会来了！,念珠菌,曲霉菌,条件致病真菌感染危险因素,国外： 血液系统肿瘤病人粒细胞减少、_骨髓移植 器官移植 ICU HIV感染,国内： 广谱抗生素应用 ICU 皮质激素 糖尿病 静脉插管,Martin et al, NEJM 2003;348:1546,脓毒血症的发病率,Edmond et al. Clin. Infect. Dis. (1999). 29:
2、239-244,Nosocomial bloodstream infections in hospitals in the USA 重要致病菌流行病学监测和控制（SCOPE）计划 1995-1998,念珠菌血行感染发病率和死亡率高,1950,1960,1970,1980,1990,2000,IA,ASP,侵袭性曲霉病的发病率也在增加,Kontoyiannis et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2002， 21:161-172 Warnock. JAC,1998,41(suppl D):95-105,Aspergillus spp.,Candida s
3、pp.,All other,Prevalence at Autopsy %,Groll et al, J Infect 1996;33:23-32.,经尸检证实的侵袭性真菌感染,国内侵袭性真菌感染的发病情况,刘正印等，中华医学杂志2003年3月第83卷第5期,54.84%,12.9%,3.23%,9.68%,19.35%,西南医院尸解资料，(1971-2000)，郝飞教授提供,Aspergillus,Cryptococcus,Mucor,Candida,All others,真菌感染流行特点 危险因素不断增多，发生率逐年增高 白念珠菌仍然是最常见的致病菌 非白念珠菌和霉菌不断增加 曲霉已成为重
4、要的致死真菌,曲霉感染: 日益严重的问题,曲霉是继念珠菌之后的第二常见真菌病原体 虽然经过治疗，免疫抑制患者的死亡率仍达90%,Andriole VT. J Antimicrob Chemother 1999;44:151-162; Groll AH et al. Adv Pharmacol 1998;44:343-500; Denning DW. Clin Infect Dis 1998;26:781-805; Andriole VT. Curr Clin Top Infect Dis 1998;18:19-36; Lin S-J et al. Clin Infect Dis 2001;32
5、:358-366; Paterson DL, Singh N. Medicine (Baltimore) 1999;78:123-138.,非白念珠菌的增多.,非白念珠菌(46.8%),白念珠菌(53.2%),Edmond et al. Clin Infect Dis 1999;29:239-44.,934例念珠菌血症,1,3,2,C. glabrata 42.3%,C. parapsilosis 21.1%,C. tropicalis 26.1%,非白念念珠菌血症,Edmond et al. Clin Infect Dis 1999;29:239-44.,美国血源性念珠菌感染种类分布 (19
6、98-2000),Hajjeh et al. (2004) J. Clin. Microbiol. 42(4):1519-1527,Other,1.12%,C.lusitaneae,1.02%,C.krusei,2.04%,C.tropicalis,12.23%,C.parapsilosis,13.25%,C.glabrata,24.46%,C.albicans,45.87%,.,我国念珠菌种类的变化,菌种 85-92 % 96-2002% 白念珠菌 80-90 43-75 热带念珠菌 10-13 10-15 光滑念珠菌 1-6 14-21 克柔念珠菌 1 5-27 葡萄牙念珠菌 1 2-5
7、新生隐球菌 1 1-5,真菌的致病特点,真菌的致病性,通过刺激人体免疫系统产生变态反应而引起真菌过敏症； 通过释放各种毒素引起人体的真菌中毒症； 向组织内侵入、增殖所引起的真菌感染是临床最常见的致病形式。,能够引起人类感染的真菌约有300余种，分为病原真菌和条件性致病真菌两类。,真菌感染的分类,根据真菌侵犯人体的部位分为四类： 浅表真菌病 皮肤真菌病 皮下组织真菌病 系统性真菌病,浅部真菌病,深部真菌病,临床常见的真菌病,浅表真菌病： 花斑癣 掌黑癣 毛结节菌病,皮肤真菌病： 皮肤癣菌病手足、体股、头、甲 皮肤念珠菌病,皮下真菌病： 孢子丝菌病 着色芽生菌病 暗色丝孢霉病 足菌肿,系统性真菌病
8、： 念珠菌病 曲霉病 隐球菌病 接合菌病 双相真菌感染,浅部真菌病,限于皮肤最外层，甲板、毛发和粘膜的感染。 主要的感染是皮肤癣菌病和浅表念珠菌病。 大多轻微，容易诊断，对治疗反应良好。,手、足、甲癣最常见的真菌病,各种头癣：传染、危害健康,皮肤癣菌直接镜检,关节菌丝,皮下真菌病,侵犯真皮、皮下组织和骨骼的真菌感染。 常通过外伤后植入在土壤和腐败的植物中腐生的病原体而获得。 好发于热带和亚热带地区的乡村人口，这些地区的居民常赤足或着装较少。 疾病可限局于外伤植入部位或播散到临近组织。通过血液或淋巴管引起的广泛播散少见，通常只发生在全身衰竭的宿主。,皮下真菌病往往经过外伤发病,孢子丝菌病,着色芽
9、生菌病,着色芽生菌病直接镜检,“Sclerotic body”,系统性真菌病,常起源于肺，可以播散到全身许多器官。 常通过吸入致病菌孢子而获得，其致病菌腐生于土壤或腐败有机物中，或作为植物致病菌。 病原体可分为两组：真正的致病菌和条件致病菌。,系统性真菌病主要的致病真菌,荚膜组织胞浆菌 粗球孢子菌 皮炎芽生菌 巴西副球孢子菌,系统性真菌病危及生命,临床常见的条件性真菌感染,临床常见的条件性真菌感染,念珠菌病: 最常见，血源感染的第4位。 曲霉菌病: 常见于干细胞移植、实体器官移植、大剂量化疗患者。 隐球菌病: 艾滋病人患病率为10-20%。 接合菌病（毛霉病）:多见于重症糖尿病、烧伤病及器官移
10、植病人。,临床有增多趋势的条件性真菌,非白念念珠菌感染 毛孢子菌感染 地霉感染 镰刀菌感染 枝顶孢霉感染 暗色真菌感染 马尔尼菲青霉,真菌感染的诊断方法,真菌感染的诊断方法,真菌镜检 真菌培养 组织病理 生理生化 血清学方法 分子生物学,真菌感染的实验诊断方法及问题,显微镜检查-阳性率？培养-时间？敏感性？意义？血清学-敏感性？特异性？分子生物学-标准化？,阿申蓝染色,H&E,PAS,组织学特点,Immunochemistry,皮肤隐球菌病的组织病理学,菌丝 孢子曲霉病的 组织病理学,Prof. Richardd Calderones lecture-2006, Beijing,念珠菌病-直接
11、镜检,隐球菌病直接镜检,曲霉病,曲霉头,曲霉病,双分支菌丝,曲霉病直接镜检,双分支菌丝,曲霉头,接合菌（毛霉）病直接镜检,粗大无分隔菌丝,各种培养法,念珠菌显色培养基CHROMagar Candida,生理学试验碳源同化,API 20 C AUX试剂盒,ID32C 酵母鉴定系统,霉菌的鉴定 两种简易的可代替小培养的制片方法,孢子发生（conidiogenesis）,真菌感染的非培养诊断,真菌感染的诊断存在问题,直接镜检-阳性率？培养检查-时间？敏感性？意义？血清学-敏感性？特异性？分子生物学-标准化？,种特异性,属特异性,真菌通用,真菌感染的非培养诊断方法,真菌细胞壁可供诊断检测的标记,Man
12、nan,1-3-beta-D-glucan,非培养诊断检测方法,G试验检测b-1,3 D-葡聚糖 ELISA法检测曲霉抗原 乳胶凝集试验检测新生隐球菌抗原 ELISA法检测念珠菌抗原 PCR_真菌通用引物、种属特异性引物,方法：G试验,-葡聚糖可特异性激活鲎（Limulus）变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故称G试验。 - b-1,3-D-葡聚糖通过激活G因子（ Factor G）引起凝集； 内毒素通过激活C因子（Factor C）引起凝集； 试剂盒: 祛除Factor C 葡聚糖特异, -1,3-D-葡聚糖检测方法,两种试剂盒 Fungitec-G (marketed in Jap
13、an) Obayashi, Lancet 345:17-20, 95 “确诊真菌感染的患者”: 90% sensitive Glucatell (approaching US licensure) Ostrosky 多中心研究 189 侵袭性真菌感染高危的患者* 每名患者取材1次: Sensitivity: 70%; Specificity 87%.,-1,3-D-葡聚糖 检测范围,不仅可检测念珠菌感染 曲霉、镰刀菌 和很多霉菌均存在-1,3葡聚糖( Miyazaki, J Clin Micro 33:3115, 95) 隐球菌细胞壁为alpha-葡聚糖,故为阴性 阳性结果只能代表存在侵袭性真
14、菌感染,不能确定种类 假阳性: 纱布，某些血液透析的滤过器等,Clin Infect Dis 2004;39:199-205,侵袭性真菌感染中葡聚糖检测,AML, MDS Receiving antifungal prophylaxis,Cut off 60 pg/ml,Clin Infect Dis 2004;39:199-205.,30,30,with candidemia,control subjects,侵袭性真菌感染的葡聚糖检测 Fungitell assay,检测曲霉半乳甘露聚糖抗原的 EIA 方法（Platelia）,检测位于曲霉细胞壁上的 galactomannan,（GM）3
15、. Detection avidin-enzyme + substrate2. Detecting Ab anti-galactomannanbiotin conjugatedAg blood, urine, BAL1. Capture antibody monoclonal anti - galactomannan,Specificity = 90% sensitivity = 75%,Platelia Aspergillus EIA 结果判断,曲霉的GM 抗原检测,乳胶凝集试验（Pastorex） (15ng/ml) 酶连免疫吸附试验（Platelia） (1ng/ml),Sabetta
16、et al. JID 1985; 152: 946 Ansorg et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994; 13: 582 Verweij et al. JCM 1995; 33: 3150 Maertens et al. Blood 2001; 97: 1604 Herbrecht et al. J Clin Oncol 2002; 20: 1898,GM 抗原,GM检测结果判定标准,阴性对照 阳性对照 阈值对照（cut off 值) 结果有效性判断： 阴性对照/阈值对照2 Index=样本值/阈值对照 阳性：1.5 阴性：1 可疑：1-1.5
17、,GM不同Cutoffs值的敏感性和特异性,Marr KA et al, J Infect Dis 2004;190:641-9,GM抗原检测用于侵袭性曲霉病诊断,与临床诊断和疗效反应有良好的一致性。 检测方法有ELISA、放射免疫分析（RIA）和乳胶凝集试验等。 Platelia试剂盒采用ELISA方法，敏感性80%，特异性80%。儿童假阳性10%。 Cut-off值影响结果0.5:早期诊断,特异性差;1.5:特异性提高。可动态观察。Dr.Maschmeyer G. in 2nd Trends in Medical Mycology, 23-26 October 2005, Berlin,G
18、M抗原ELISA检测应用 （Platelia试剂盒）,48例患者：确诊IA4例，3例阳性；高度怀疑IA13例，8例阳性；可疑IA31例，2例阳性。,王，等。临床皮肤科杂志，2006。,灵敏性为64.7% 特异性为93.5% 假阳性率为6.5% 假阴性率为35.3%,曲霉 GM 抗原系列监测,n = 362 高危粒细胞缺乏病人 Sandwich ELISA 2 times weekly, 11.7% 阳性 n = 30 proven IA n = 9 probable IA n = 264 with no IA 敏感性 89.7% 特异性 98.1% 阳性预测值PPV 87.5% 阴性预测值NP
19、V 98.4%,Maertens J et al, Blood 2001;97:1604-10,曲霉感染检测的影响因素,半乳甘露聚糖在血中存在时间短，建议：高危人群每周至少检测2次，动态观察结合影象学、培养结果综合分析诊断,假阴性,假阳性,哌拉西林/他唑巴坦 与其它细菌或真菌成分有交叉反应 肠道中定植的曲霉释放GM进入血液循环 含有谷物的食物中存在GM抗原，通过受损肠黏膜进入血循环导致抗原血症，化疗后出现严重黏膜炎的更易发生,检测真菌DNA的PCR试验,标本： 全血 血清 活检组织 BAL CSF,不同方法： DNA 提取 PCR 设计 产物检测,PCR,PCR技术用于诊断,种特异-PCR 非
20、特异 PCR 杂交,Standart “single“ “nested“ PCR-EIA “Real-time“,标本 全血 血浆 血清 BAL,最低检测范围 4-10 cfu/ml 25-100 fg DNA,原位杂交,目的基因 多拷贝基因,PCR 检测和鉴定多引物 多样本制备 高敏感度: 1 - 100 cells/mlpan-fungal PCR 敏感度： 100% (多个标本) 与治疗一致,J Clin Microbiol 1997;35:1353-60,SPEED,PCR过筛试验诊断IA,每周监测2次通用引物; 确定采用巢式和实时定量; 敏感性100%,特异性65%; 早于临床症状2
21、天,早于确诊9天; 动态观察持续阴性可排除;,Dr.Maschmeyer G. in 2nd Trends in Medical Mycology, 23-26 October 2005, Berlin, Germany.,Jun Zhao et al. JCM 2001,Nested PCR in Animal Models,余进，等。中华检验医学杂志，2003,种特异引物巢式 PCR扩增烟曲霉rRNA基因,动物模型中巢式PCR方法检测的灵敏度,灵敏度=77.8%,余进，等。中华检验医学杂志，2003,完成全基因序列测定的病原真菌,白念珠菌等致病性念珠菌 新生隐球菌 粗球孢子菌 烟曲霉、构巢
22、曲霉等数种曲霉 组织胞浆菌 卡氏肺孢子菌,突破方向,对基因组序列和功能的了解，找出特异处 改进目前方法，提高敏感性 Real-time PCR 多重PCR 芯片技术 其它特异抗原,DNA 微阵列,芯片、探针: Candida spp. Aspergillus spp. 临床标本: 10-20 cfu/ml body fluid PCR electrophoresis: 75.6% DNA microarray: 87.9% Zhu et al. AAA. San Francisco, 9-12th September 2004,真菌非培养诊断小结,在诊断侵袭性真菌感染有一定价值，尤其早期诊断和疗效监测 理想的检测方法很少 隐球菌乳胶凝集 曲霉ELISA Glucan PCR方法有待验证 多次取材重要 结合临床表现、真菌学等传统方法和影象学,122 patients 323 samples 33 proven cases,肺曲霉病诊断时间表,Kami M et al, Clin Infect Dis 2001;33:1504-12,谢谢大家!,
