1、脂血因素对荧光定量 PCR 检测乙肝病毒DNA 的影响及解决措施临床检验杂志 2007 年第 25 卷第 5 期ChineseJournalofClinicalLaboratoryScience,2007,Vo.25,No.5359文章编号:10o1764x(2o07)05-0359-02 中图分类号:R446.6 文献标识码:A?实验研究?脂血因素对荧光定量 PCR 检测乙肝病毒 DNA 的影响及解决措施高峰,高慧华,杨学文(1.江苏省中医院检验科,南京 210009;2.南京市迈皋桥医院内科,南京 210000)摘要:目的分析脂血程度对荧光定量 PCR 检测乙肝病毒 DNA(HBVDNA)
2、的影响,并选择有效去除脂血对 HBVDNA 测定干扰的方法.方法采集 29 名 HBVDNA 值10eopies/m的乙肝青壮年志愿者空腹和高脂肪餐后 2,4,6h 静脉血,测定血清三酰甘油(TG)和 HBVDNA;选用低温高速离心法和乙醚萃取法处理脂血标本,测定清亮血清 HBVDNA.结果 TG 水平轻度升高时血清 HBVDNA 测定值有 61%超出允许误差范围 ,且 TG 水平越高,超出允许误差范围百分率越高,差值越大;TG 水平重度升高时,出现假阴性结果;低温高速离心法去除脂血因素干扰效果较萃取法好.结论高血脂对荧光定量 PCR 检测HBVDNA 结果存在影响,通过低温高速离心可以有效去
3、除脂血因素干扰 .关键词:脂血;肝炎病毒;荧光定量 PCR;高速离心随着脱氧尿核苷三磷酸(dUTP)防污染技术的应用,PCR 技术的假阳性已逐步减少,但仍有较多的假阴性标本存在.日常工作中发现脂血因素会导致血清 HBDNA 测定结果偏低或出现假阴性,本文就脂血程度对 HBVDNA 定量检测的影响及如何去除脂血因素干扰作了一些探讨.1 材料和方法1.1 标本来源和采集病例由南京迈皋桥医院高慧华医生提供,TG 正常(TG1.69mmol/L), 实时荧光定量 PCR 测定 HBVDNA10 拷贝/ml 的乙型肝炎患者共 29 人,其中男性 18 人,年龄 2334岁(平均 27 岁); 女性 11
4、 人 ,年龄 2532 岁(平均28 岁).空腹抽取静脉血 3ml;高脂肪餐后 2,4,6h 分别抽取静脉血 3ml,分离血清.1.2 仪器与试剂 Rotor.Gene2000 型实时荧光定量 PCR 检测系统,OlympusAU2700 型全自动生化分析仪,Eppendorfcentrifuge5417R 型高速冷冻离心机.HBVDNA 荧光定量试剂盒(深圳匹基公司,最低检测限 10 拷贝/m1),TG 试剂(德国普瑞亚诊断试剂),乙醚 (上海试剂一厂).1.3 去脂处理1.3.1 低温高速离心法 15000r/rain,4离心15rain 分离血清.吸弃乳糜微粒层,收集下层清亮血清.1.3
5、.2 萃取法取分离血清与乙醚 1:1 混匀,震荡30S,室温静置 5rain,3500r/rain 离心 5rain,吸头穿过乙醚层吸取下层清亮血清.作者简介:高峰,1977 年生,男,技师,本科,从事分子生物学检验 .1.4 检测方法1.4.1TG 分析酶法测定,生化分析仪参数按试剂说明书设置;NCEP ATP11 文件将血清 TG 分为四个水平:极高(5.64mmol/L),升高(2.265.63mmol/L),临界范围(1.69 2.25mmol/L),合适水平(1.69mmol/L).在本实验中,将升高拆分为轻度升高(2.263.95mmol/L)和重度升高(3.965.63mmol/
6、L).根据 TG 测定结果将血清标本分为不同的 5 个 TG 水平组(空腹血清除外).1.4.2HBVDNA 检测采用实时荧光定量 PCR法,实验操作,反应体系及扩增条件严格按照试剂说明书进行.1.5 统计学分析将血清 HBVDNA 定量结果换算成对数值进行统计,假设空腹血清 HBVDNA 测定值为真值,脂肪餐后,去脂处理后血清 HBVDNA测定值与空腹血清 HBVDNA 测定值进行比较,判断是否超出允许误差(0.5 个对数数量级);5 个 TG水平组与空腹血清 HBVDNA 测定值差值的显着性检验采用组间 t 检验.2 结果2.1 不同 TG 水平对 HBVDNA 结果的影响 TG水平轻度升
7、高时血清 HBVDNA 测定值有 61%的患者超出允许误差范围,且 TG 水平越高,超出允许误差范围百分率越高.统计分析不同 TG 水平组血清HBVDNA 测定值与空腹血清 HBVDNA 测定值差值,除合适水平和临界范围组之间无显着性差异(P0.05),其他各组之间均有显着性差异(P360 临床检验杂志 2007 年第 25 卷第 5 期ChineseJournalofClinicalLaboratoryScience2007,Vo1.25,No.50.05),并且 TG 越高,差值越大.TG 水平重度升高时出现假阴性结果.见表 1.表 1 空腹,脂肪餐后和去脂处理后血清 HBVDNA 测定结
8、果比较组别例数低于检测下限者所占%空腹血清 290脂肪餐后血清 TG 水平(mmol/L)合适水平(169)140临界范围(1.692.25)210轻度升高(2.263.95)180重度升高(3.96 一5.63)234极高(/5.64)1128去脂处理后血清低温高速离心法 870乙醚萃取法 870超出允许误差范围者所占%OO61781OOO100差值(iS)O.22O.1OO.28O.11O.62O.17O.81O.241.14O.270.24-t-O.O9O.78O.172.2 低温高速离心法和乙醚萃取法去除脂血因素干扰能力的比较 2 种去脂方法处理脂肪餐后血清后,87 份标本经检测 HB
9、VDNA 均高于检测下限.低温高速离心法处理后血清 HBVDNA 测定值均在允许误差范围内,乙醚萃取法处理后血清 HBVDNA测定值均超出允许误差,两者之间差值的比较具有显着性差异(P0.05).见表 1.3 讨论血清脂浊主要是由于乳糜微粒增多引起,人血清乳糜微粒中含有近 84%88%的 TG,TG 水平可以客观地反映脂血程度.正常人 TG 水平大多数在脂肪餐后 2h 达高峰,46h 开始下降,8h 接近空腹水平.采集乙肝患者空腹及脂肪餐后 2,4,6h血清,模拟了真实的经过肝脏代谢过程的不同 TC水平的脂血标本.分析发现 TG2.26mmol/L 时血清 HBVDNA 测定值偏低,有的超过两
10、个数量级甚至出现假阴性,对扩增曲线进行分析,发现脂血标本荧光信号强度较空腹标本低,部分荧光信号很弱,进入指数扩增期的时间延迟,我们认为脂血因素造成结果偏低的原因可能有:脂血因素导致荧光猝灭,使得荧光信号强度降低,抑制 Taq 酶的活性,使得扩增效率降低.目前,生活水平提高,高脂血症患者逐渐增加,乳糜样脂血标本日益增多,去除脂血因素对 HBVDNA 检测的干扰具有现实意义,同时也可以降低乙肝患者血样采集的要求,方便病人.在去除脂血因素对生化测定干扰的研究中.J,高速离心法和乙醚萃取法用于去除脂血因素对某些生化指标的干扰有很好的效果,在实验中选用 2 种方法对脂血标本进行处理,并根据高血脂血清在冷
11、冻(藏)后乳糜微粒会有一部分漂浮在血清上面的现象,将高速离心法改良为低温高速离心法,取得了更好的效果.去脂处理后,对血清 HBVDNA 测定结果进行分析,发现低温高速离心法能较好地解决脂血因素的干扰问题,同时可以认为导致荧光信号强度降低的主要原因是乳糜微粒的存在.乙醚萃取法虽然能够去除乳糜微粒的影响,但其测定结果平均比真值相差近一个数量级,这可能与乙醚萃取时病毒颗粒损失和/或乙醚残留影响 PCR 反应体系有关.在实验过程中,曾考虑过采用稀释法,将脂血因素降低到可以接受的程度,但其影响因素太多,不具备可操作性.参考文献-1李健斋.正常人脂肪餐后血脂反应的初步观察J.中华医学检验杂志,1997,20(5):278-2802石凌波,史惠群 .利用高速离心法消除脂血对生化测定的干扰J.检验医学,2004,19(2):138 1403郑治纲,杨可 ,蔡迪娅,等.脂血经乙醚处理后对生化指标测定结果的影响J.陕西医学检验,2000,15(2):28-29(收稿日期:2007-03 26,修回日期 :2007-06-01)(本文编辑: 杨林)脚代一代一 6 殳胡一发磷一阅一一真迎一一传欢一#蟛(,霸活一寓 n,_.一一西一稿舳一一一一一一篙一
