1、肝细胞核因子 1 基因突变与年轻的成人发病型糖尿病 3上海医学 2004 年第 21 鲞筮!塑肝细胞核因子 1 基因突变与年轻的成人发病型糖尿病 3方启晨项坤三年轻的成人发病型糖尿病(maturity onsetdiabetesoftheyoung,MODY)是一种单基因突变所致的糖尿病,其特点为发病年龄小于 25 岁,无酮症酸中毒,糖尿病传递符合常染色体显性遗传规律,诊断后至少 2 年内不用胰岛素J.MODY 是一组遗传异质性疾病,已发现至少有 6 种基因突变可导致该病:肝细胞核因子(HNF)4a 基因(MODY1), 葡萄糖激酶(GCK)基因(MODY2),HNFla 基因(MODY3),
2、胰岛素启动因子一 1(IPF 一 1)基因(MODY4),HNF 一 1B 基因(MODY5)及神经源性分化因子 1/1B 一细胞 E 盒转录因子 2(NeuroD1/BETA2)基因 (MODY6).这些基因突变均导致胰岛 B 一细胞分泌功能障碍.总体而言,MODY 的胰岛素分泌水平低于 2 型糖尿病而高于 1 型糖尿病.MODY 的患病率具明显的种族差异,白种人患病率较高,在美国及其他工业化国家其发病率占所有糖尿病的 1%5%_2J.在大多数人群中,HNFla基因突变所致的 MODY3 最为常见.一,HNF 一 1aHNFla 为肝细胞核因子家族(HNFs)成员之一,又称转录因子 1(TC
3、F1),与 HNF1B 同属于包含同源域类转录因子.最初认为它是肝脏内特异性表达的转录因子,在肝细胞发育,分化中起调节作用;进一步研究发现,它在小肠,胃,肾近曲小管及胰腺等上皮细胞均有表达 j.HNFla 能调控包括白蛋白,B 一纤维蛋白及 a 一 1 抗胰蛋白酶等一系列肝脏特异基因的转录,而且研究发现其在肝脏调节脂蛋白的生物合成,在胰岛 B 氇日胞调控胰岛素基因的表达,调控编码涉及葡萄糖转运和代谢及线粒体代谢蛋白的基因表达,而这些均与胰岛素分泌相关_2J.HNF la 还是一个辅助因子,它增强胰岛素基金项目:上海市卫生局科技发展基金资助项目(034043)作者单位:200233 上海交通大学
4、附属上海市第六人民医院上海市糖尿病研究所537?综述?对葡萄糖 6 磷酸酶基因的转录抑制作用,而该酶与糖异生及糖原合成有关 J.HNFla 由 631 个氨基酸组成,有 3 个功能域:氨基端(N 端) 二聚体结构域(氨基酸 132),中间含 POU(Pit,Oit 和 Unc 的缩)样基序和同源基序的 DNA 结合结构域(氨基酸 150280),羧基端(C 端)转录激活结构域(氨基酸 281631).HNF 一 1a 主要以同二聚体或与 HNF 一 1B 以异二聚体的形式存在,与具有 GTTAATnATTAAc 共有序列的回文顺式激活 DNA 元件结合,激活并调控基因转录_4J.二聚体结构域,
5、POU 样基序和同源基序高度保守.HNFla 二聚化形成一个分子间的4 一螺旋束 5,二聚体结构域可以被 DCoH(dimerizationcofactorofHNF1)所结合 ,DCoH 是相对分子质量为 11000 的小分子蛋白,它不与 DNA 结合,但降低二聚体构型中 HNFis 分子的交换率,稳定二聚体并提高转录活性.POU 样基序与 POUA结构域有弱同源性,其对 HNFis 的高度特异性识别起重要作用.HNFis 通过一个特别大的同源结构域(81 个氨基酸) 与 DNA 结合.X 线衍射分析及核磁共振分析表明,该结构域有一不常见的含4 个 a 一螺旋转角螺旋的基序,在第 2 与第
6、3 螺旋之间存在 1 个 21 个氨基酸的环 J,且在编码这 2 个螺旋的序列间存在 1 个内含子.HNFis 的转录活性取决于 C 端,特别是 c 端富含丝,苏氨酸残基的区域.在翻译过程中,选择不同的聚腺苷酸化位点及不同的拼接编码了不同的 HNF 一 1a 异构体,即HNF 一 1aA,HNF 一 1aB 及 HNFisC,它们具有不同的 C 端结构域,瞬时转染分析提示,HNFis B与 HNFlaC 的转录活性为 HNFisA 的 5 倍,与其 c 端氨基酸序列的不同有关;HNF.is B 和HNF 一 1aC 均可形成同或异二聚体,与 DNA 的特异结合亦同 HNFisA 相似;这些异构
7、体的 mRNA于胎儿及成人期中在肝,肾及小肠的表达不同,提示它们在器官发育过程中发挥不同作用.人 HNFla 基因定位于染色体 12q24.2,包含10 个外显子,全长约 23kb【,在脊椎动物中高度保守,与小鼠的同源性高达 94%.此外,HNF1a基因表达受到 HNF 一 4a 的调控2J.二,HNFla 基因突变及 MODY3 临床特点迄今发现与 MODY3 有关的 HNFla 基因突变有近百种2J,分布于启动子区及 10 个外显子区 ,其中包括拼接位点的突变,这些突变包括移码突变,错义突变及无义突变.其中最常见的是P29lfsinsC,约占 MODY3 的 20%,为白种人的突变热点【7
8、,但不是中国人早发糖尿病的致病原因.在点突变中有多个 CG-TG 及 CG-CA 碱基替代,这种突变在 HNF.1a 点突变中所占比例较高,提示甲基胞嘧啶在 CpG 二核苷酸的脱氨基可能是致 HNFla 突变的一个重要原因4J.插入或缺失突变均导致移码,最常见的 P291fsinsC 突变即是在外显子 4 的多 C 序列间插入 1 个碱基 C 致阅读框架位移.连续相同的碱基很容易在复制叉处由于滑动错配而形成 1 个碱基的插入或缺失,因此多 C 序列是这种突变的潜在根源.在 HNF.1a基因的重复序列处,还有许多其他的插入/缺失突变,如密码子 379 有 3 种不同的插入/缺失突变,而密码子 4
9、43 则会发生 CA 缺失,这两个密码子分别处在 C5TC6T 及 CACA 重复序列处.另 1 个移码突变 I414G415ATcG-CCA,即在外显子 6 的密码子 414/415 处同时有 1 个 CC 插入和 1 个 TCG 缺失,这个突变估计是存在 1 个准回文序列形成发夹结构所致,由于插入 CC 和缺失 TCG 可得到 1 个更稳定的发夹结构.作为 MODY 的一种亚型,MODY3 患者大多在 10 岁前具有正常的空腹血糖及葡萄糖耐量,随着进行性胰岛素分泌受损,发生明显的高血糖并常伴微血管并发症,但无胰岛素抵抗.部分患者需要药物治疗,尽管没有自身免疫性 8 细胞损害,约30%的患者
10、最终需胰岛素治疗8J.采用分级葡萄糖输注方法观察 MODY3 突变者葡萄糖刺激后胰岛素分泌率(ISR)发现,MODY3 突变糖尿病患者 ISR 显着降低,MODY3突变非糖尿病患者在血浆葡萄糖浓度为 7.08.0mmol/L 时,其 ISR 与正常对照者相似,而血浆葡萄糖水平高于 8.0mmol/L 时,其 ISR 的上升率明ShanhaiMedJ,2004,Vo【 27,No7显低于对照者,提示 MODY3 突变者葡萄糖诱导胰岛素分泌受损.Hansen 等lUu 发现,HNFla 基因P447L 突变者在葡萄糖耐量试验时,其 8 细胞对静脉促分泌素甲苯磺丁脲和胰高糖素高度兴奋.以高糖钳夹及正
11、糖高胰岛素钳夹分析 HNF.1a 基因P291fsinsC 突变患者胰岛素分泌 ,葡萄糖的利用和葡萄糖的产生时发现,高糖钳夹时 MODY3 患者胰岛素第一,第二分泌相均消失;与正常对照者相比,其葡萄糖的氧化和非氧化利用降低,对内源性葡萄糖的产生和脂肪分解的抑制作用减退.在高胰岛素钳夹时,MODY3 患者周围组织胰岛素敏感性没有改变,但对内源性葡萄糖产生的抑制作用受损l.Pearson 等lJ 研究发现,HNF.1a 基因突变者空腹血糖水平升高,且以 0.06mmol/fl随年龄增加而上升;与对照组相比,其胰岛素敏感性显着增加.MODY3 患者血浆胰岛素浓度在葡萄糖诱导及基础条件下均减少,而后者
12、反映了胰腺胰岛素质量下降或 8 细胞群减少,这可能是至少 30%的MODY3 患者需要胰岛素替代治疗的原因.Menzel 等引发现 1 个具.肾糖再吸收障碍的MODY3 家系,与 1 型糖尿病患者相比,其.肾糖阈显着下降,提示.肾糖阈降低可能是 HNF.1a 基因突变的胰外效应.Pontoglio 等 J 发现,HNF.1a 突变小鼠患糖尿病的同时还患有以严重尿糖,尿内磷酸盐过多及氨基酸尿为特征的.肾 Fanconi 综合征.进一步研究 HNFla 缺陷小鼠证实,葡萄糖小管再吸收下降这个.肾胞壁质缺陷由低亲和力,高容量的葡萄糖协同转运因子 SGLT2 表达减少所致,而HNF.1a 直接控制 S
13、GLT2 基因的表达,因此在葡萄糖体内平衡中起重要作用.MODY3 患者微血管并发症发生率在 1 型与 2型糖尿病患者中无差异,此与血糖控制程度相关.血流及毛细血管压力异常可能与糖尿病微血管病病因有关,用激光多普勒流量仪分析见到,MODY3患者的血管收缩模式与 1 型糖尿病相似,而与 2 型糖尿病不同,提示 G 一细胞功能障碍与胰岛素抵抗对微血管有不同的影响l.此外,还发现 HNFla 基因有许多种多态,其中 G319S 仅在加拿大 OjiCree 人中见到,其突变纯合子者与杂合子者患 2 型糖尿病的风险因子(oddsratios)分别为 4.00(95%CI 为 2.656.03)和 1.9
14、7(95%CJ 为 1.442.70);Ala98Val 杂合子者口服葡萄糖后 30min,其 c 肽水平与野生上海医学 2004 年第 27 卷箍 7 期型者相比降低 20%,而 lle27Leu 及 Ser487Asn 多态性与糖兴奋后 c 肽及胰岛素水平无关 17-19.HNFla 基因突变在许多种族中均可见到_l2 一,是英国人 MODY 的主要致病原因.MODY3 在MODY 中所占比例在英国人中为 73%20J,在丹麦白种人中约 56%【加 j,在德国人中约 36%l,在法国人中约 25%l,在北美和芬兰人中为 26%li,在日本人中为 8%L2.在中国 HNFla 基因突变仅个别
15、报道,对香港人群的筛查见到错义突变 G20R,R203H,S432C,I618M 及剪接受体位点突变 IVS2nt 一 1G-A_l2.三,HNFla 基因突变对基因功能的影响HNF-la 基因突变使一些蛋白稳定性下降,另一些或是在 DNA 结合上存在缺陷或是其转录激活能力受损.例如:二聚体结构域的 L12H 突变会影响其同源及异源二聚体的形成;在 DNA 结合域的 K205Q,R263C 突变会影响其 DNA 的识别与结合;产生截断蛋白的 P379fsdelCT 及 T392fsdelA 突变则可能影响其转录活性.HNFla 基因突变可能是通过单体不足/基因剂量效应或显性负性效应致糖尿病.突
16、变蛋白具有完整的二聚体结构域,但这种突变型蛋白与野生型蛋白结合形成的二聚体抑制野生型的活性与功能则称为显性负性效应.其他与 MODY3 表型相关的发生在二聚体结构域的突变,发生在启动子区导致表达减少的突变,产生不稳定且很快降解的截断蛋白的突变和使得转录活性下降的突变则可导致单体不足.在突变中,错义突变遍及所有功能域,而突变在 POU 样基序和同源基序密度最大,提示与 DNA 结合相关的结构域对单个氨基酸改变的敏感性大于转录激活域.常见的 P291fsinsC 突变编码了 1 个 315 个氨基酸的截断蛋白,相对分子质量为 44000(野生型为 88000),它有完整的二聚体结构域及 DNA 结
17、合域,丧失了大部分转录激活结构域,由电泳迁移率分析(EMSA)证实 P291fsinsC 蛋白可与野生型蛋白形成异二聚体,在野生型蛋白中增加突变蛋白的数量,可以观察到其活性的下降,提示P291fsinsC 突变是一种显性负性突变 .Wang等 3J 提出,位于细胞核的 P291fsinsC 蛋白以HNF1QP291fsinsC 同二聚体及 HNF1QP291fsinsC-HNF1QWT 异二聚体形式与野生型HNF 一 1a 竞争同源 DNA 结合位点发挥其显性负性效应.HNFlaP29lfsinsC 直接抑制胰岛素基因启动子活性,使胰岛素表达减少.因此正常的 HNF1a 功能对于胰岛素基因的转
18、录是必需的.他们发现涉及葡萄糖转运和代谢的葡萄糖转运蛋白 2(GLUT 一 2)及 L 型丙酮酸激酶(LPK)受 HNF 一 1Q调控,HNFIRP291fsinsC 抑制 G 细胞膜的 GLUT2,并降低葡萄糖及亮氨酸线粒体的代谢,使 ATP和增加细胞内 ca 浓度及胰岛素胞泌作用所需的其他线粒体因子产生减少,影响线粒体膜超极化和j3 细胞膜去极化,致使葡萄糖,亮氨酸等营养物诱导的胰岛素分泌严重受损.他们还发现,HNFla调控多种影响胰岛 j3 细胞功能及对代谢一分泌耦联有重要作用的基因,除了使得胰岛素,GLUT 一 2,LPK,醛缩酸 B 及 3 一羧基一 3 一甲基戊二酰基辅酶 A 还原
19、酶等基因表达减少,HNFlaP291fsinsC 显着抑制线粒体酮戊二酸脱氢酶(OGDH)的 E1 亚单位mRNA 及蛋白质的表达,OGDH 酶活性降低,丙酮酸氧化减少,与之相反,线粒体解耦联蛋白 2(UCP2)mRNA 及蛋白水平显着增加,而有研究报道,在大鼠胰岛过度表达的 UCP2 抑制葡萄糖诱导的胰岛素分泌.此外,DNA 结合域的突变R272C 和 K158N 也被认为是显性负性突变 26,27.在启动子区的突变则可导致单体不足,启动子区 nt 一 283AC 及 nt 一 218TC 突变型的转录活性分别是野生型的 30%和 70%28.四,MODY3 的诊断由于 MODY3 患者起病
20、较早,且与其他亚型相比有较严重的胰岛素分泌障碍,因此常与 1 型糖尿病相混淆.在日本有 5.5%的 1 型糖尿病由 HNF 一1a 基因突变所致 ,在丹麦有 10%不具高风险 HLA单倍型 1 型糖尿病由 HNFla 基因突变所致,因此临床上对糖尿病家族史和遗传方式的研究有助于对这些 MODY3 患者的确认及重新分型.明确诊断非常重要,可及时治疗并防止并发症的发生.随着分子生物学检测技术的发展,对 MODY 患者进行实验室诊断正在成为可能.了解 MODY 这些单基因疾病,将增进对葡萄糖代谢紊乱的认知,从而更好地了解常见的 2 型糖尿病.参考文献1GlucksmannMA,LehtoM,Tayb
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