1、食品安全国家标准 食品微生物学检验 创伤弧菌检验（征求意见稿） 编制说明一、工作简况（包括任务来源与项目编号、标准起草单位、协作单位、主要起草人、简要起草过程）1、 任务来源本项目由食品安全国家标准审评委员会负责，根据国家卫生和计划生育委员会食品安全标准与监测评估司下达的 2017 年食品安全国家标准制修订计划，委托国家食品安全风险评估中心负责起草制定食品安全国家标准 食品微生物学检验 创伤弧菌检验 ，并按照国家卫生和计划生育委员会食品安全标准与监测评估司的工作安排，对该标准进行起草，标准项目编号为 spaq-2016-189。2、 标准起草单位、主要起草人标准起草单位：国家食品安全风险评估中
2、心；主要起草人：李凤琴、白瑶、叶淑瑶、王伟、甘辛、胡豫杰、董银苹。3、 简要起草过程（1）2016 年 12 月，国家卫生和计划生育委员会食品安全标准与监测评估司委托国家食品安全风险评估中心承担该标准的制订工作，签订任务委托书。（2）2016 年 12 月2017 年 2 月，国家食品安全风险评估中心开展关于国内外创伤弧菌检验方法标准制定、研究文献、行业现状的调研准备工作。（3）2017 年 2 月，标准主要起草人员对标准起草原则、技术要求和实施细则等进行了学习讨论。（4）2017 年 3 月，国家食品安全风险评估中心微生物实验部召开参与该标准制定的相关技术人员工作研讨会议，商讨海产品中创伤弧
3、菌标准检测方法的课题设计，并制定课题研究计划，对实验中所用的试剂耗材进行订购，对关键影响因素如培养基种类、增菌液种类、各种试剂浓度等分别进行比对考察。（5）2017 年 3 月2017 年 9 月，国家食品安全风险评估中心微生物实验部开展水产品中创伤弧菌标准检测方法研究，对各实验步骤、所用仪器设备、试剂及浓度、实验技术参数进行优化，并组织 3 家省级以上检测单位对该方法进行验证，同时采集市场上销售的水产品，利用所建方法对其中的创伤弧菌进行检测。2017 年 9 月底完成实验方法的建立、验证和实验数据的汇总。（6） 2017 年 9 月底，将标准送审稿下发给相关同行评审专家征求意见，10 月中旬
4、收回全部专家意见并汇总；（7）2017 年 10 月下旬，国家食品安全风险评估中心微生物实验部对前期研究实验结果进行归纳、总结及分析，并提出标准方法，形成标准检测方法的送审稿和编制说明，汇总了同行专家评审意见。（8）2017 年 10 月底，提交食品安全国家标准 食品微生物学检验 创伤弧菌检验（送审稿） 、 编制说明和征求意见汇总表供食品安全国家标准审评委员会审议。二、标准的重要内容1、 实验方法（1） 实验所用菌株的准备创伤弧菌标准菌株 2 株（CICC10383、CICC21615） ；创伤弧菌分离株 16 株；海产品中常污染的、经生化鉴定的背景干扰菌，包括：溶藻弧菌、副溶血性弧菌、霍乱弧
5、菌、河流弧菌等。（2） 创伤弧菌分离所需最适选择性培养基的筛选增菌液的筛选：为评价创伤弧菌和背景干扰菌在选择性增菌液中的生长情况，将创伤弧菌标准株和海产品中的常见干扰菌分别制备菌悬液，并定量接种于氯化钠含量为1%，2%，3% 的 APW 增菌液和多黏菌素 E 含量为 0，1 U/mL，2 U/mL，3 U/mL，4 U/mL的 PNC 增菌液中，增菌后通过平板计数法评价创伤弧菌在不同增菌液中的生长状况。分离平板的筛选：为评价选择性培养基对创伤弧菌和背景干扰菌生长的影响，分别将创伤弧菌标准菌株和常见干扰菌定量接种于 3% 氯化钠 TSA 平板和 TCBS、弧菌显色平板、mCPC 和 CC 4 种
6、选择性平板， 37培养 18 h 后进行菌落计数，比较选择性平板和 3% 氯化钠 TSA 平板上的菌落数差异。最适培养基的确证：为评价选择性培养基对创伤弧菌的分离效果，取 25 g 新鲜海产品样品匀浆，置于 3%氯化钠的 APW 和 PNCC 肉汤增菌 18 h 后，分别取 100 L 增菌液涂布于 TCBS、弧菌显色平板、 mCPC 和 CC 4 种选择性平板，37培养 18 h 后进行菌落计数，观察背景菌对创伤弧菌生长的影响。（3） PCR 方法在创伤弧菌检测中的应用PCR 检测样品匀浆液制备：将水产品样品匀浆后，离心洗涤弃上层清液，加入超纯水使之重新悬浮，煮沸 10 min 后，1200
7、0 r/min 离心 10 min，上层清液即为样品 DNA 模板，PCR 检测创伤弧菌的种属特异性 vvhA 基因。PCR 检测样品增菌液：参考美国 FDA BAM Chapter 9 推荐的方法检测样品中的创伤弧菌，将样品增菌后划线接种于选择性平板的同时，取新鲜增菌液提取 DNA，PCR 检测vvhA 基因，统计 PCR 结果阳性样品与分离鉴定结果相吻合的比例，验证 PCR 方法是否可以应用于增菌液中创伤弧菌的检测。2、 实验结果创伤弧菌分离用最适增菌肉汤为多黏菌素 E 添加量为 1U/mL 的 PNC 增菌液；创伤弧菌分离用较适选择性平板为 CC 平板或 mCPC 平板；PCR- vvh
8、A 基因检测用于未增菌样品匀浆液中创伤弧菌初筛实验不可行，但可用于增菌后增菌液中创伤弧菌的初筛。三、国内和国际标准情况本标准方法制定中主要依据目前国际上常用的创伤弧菌检测方法，包括美国食品和药品管理局（FDA）发布的细菌分析学手册（BAM）第九章、国际标准化组织（ISO）发布的 ISO/TS 21872-2: 2007、ISO/FDIS 21872 (E)：2017、加拿大卫生部发布的 MFLP-37 以及日本厚生劳动省发布的食品卫生检查指南，结合我国食品中污染的干扰菌类别及其耐药情况，并对检测中所需的增菌液及选择性分离平板进行了优化。国内相关法规标准包括行业标准 SN/T 2754.13-2011 和一些地方标准等。
