1、 2009 PerkinElmer层 析技 术简 介2一 .液相层析的原理和参数二 .层析方法确定的步骤和优选3液相 层 析的原理和参数层 析的种 类分子排阻 层 析 Gel Filtration离子交 换层 析 Ion Exchange(IEC)疏水 层 析 Hydrophobic Interaction亲 和 层 析 Affinity金属螯合 层 析 (IMAC)4分子排阻 层 析 Gel Filtration分子排阻 层 析又可称 为 凝胶 层 析或分子 筛层 析，是按照蛋白 质 分子量大小 进 行分离的技 术 。 单 个凝胶珠本身象个 “筛 子 “。不同 类 型凝胶的 筛 孔的大小不同
2、。如果将 这样 的凝胶装入一个足 够长 的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白 质样 品加到凝胶柱上 时 ，比凝胶珠平均孔径小的蛋白 质 就要 连续 不断地穿入珠子的内部， 这样的小分子不但其运 动 路程 长 ，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白 质 ，把它 们 从柱子上洗脱下来所花 费 的 时间 越 长。凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白 质 直接通过 凝胶珠之 间 的 缝 隙首先被洗脱下来。凝胶 过滤 所用的凝胶孔径大小的 选择 主要取决于要 纯 化的蛋白 质 分子量。 5分子排阻 层 析 Gel Filtration6离子交 换层 析 Ion Ex
3、change(IEC)离子交 换层 析（ Ion Exchange Chromatography简 称 为 IEC）是以离子交 换剂为 固定相，依据流 动 相中的 组 分离子与交 换剂 上的平衡离子 进 行可逆交 换时 的 结 合力大小的差 别 而 进 行分离的一种 层 析方法。固定相是离子交 换剂 的 层 析分离技 术 。 样 品中待分离的溶 质 离子，与固定相上所 结 合的离子交 换 ，不同的溶 质 离子与离子交 换剂 上离子化的基 团 的 亲 和力和 结 合条件不同，洗脱液流 过时 ， 样 品中的离子按结 合力的弱 强 先后洗脱7离子交 换层 析 Ion Exchange(IEC)8疏水
4、 层 析 Hydrophobic Interaction固定相由非极性物 质 (如 烃类 、苯基等 )组 成的 层 析。非极性分子 间 或分子的非极性基 团间 具有吸引力，不同分子的非极性基 团 与固定相非极性物 质结 合的 强 弱不同，从而达到分离。多用于蛋白 质 分析和分离9亲 和 层 析 Affinity利用分子与其配体 间 特殊的、可逆性的 亲 和 结 合作用而 进 行分离的一种 层 析技 术 。可以 选 用生物化学、免疫化学或其他 结 构上吻合等亲 和作用而 设计 的各种 层 析分离方法。如用寡脱氧胸苷酸 -纤维 素分离 纯 化信使核糖核酸；用 DNA-纤维 素分离依 赖 DNA的
5、DNA聚合 酶 ；用琼 脂糖 -抗体制 剂 分离抗原；用金属螯合柱分离 带 有成串 组 氨酸 标签的重 组 蛋白 质 等。10亲 和 层 析 Affinity11金属螯合 层 析 (IMAC)金属螯合 层 析是利用固定相偶 联 的配基 亚 氨基二乙酸 (IDA)及金属离子 发 生螯合作用， 该 金属离子又与蛋白分子中的某些含有 巯 基或咪唑 基的氨基酸 结 合。 金属螯合 层 析主要分 为 3个 阶 段：第一 阶 段是螯合介 质 与二价金属离子作用生成金属螯合介 质 ；第二 阶 段是在一定的条件下金属螯合介 质与被分离蛋白 质 分子形成金属螯合复合物；第三 阶 段是从金属螯合介质 上将被分离物
6、 质 解吸下来。 12金属螯合 层 析 (IMAC)13层 析的一些参数 吸附等温 线 塔板效率 动态载 量14层 析的参数 1-吸附等温 线概念：吸附等温曲 线 是指在一定温度下溶 质 分子在两相界面上 进 行的吸附 过 程达到平衡 时 它 们 在两相中 浓 度之 间 的关系曲 线 。在一定温度下 ,分离物 质 在液相和固相中的 浓 度关系可用吸附方程式来表示15层 析的参数 1-吸附等温 线吸附等温 线 ： 线 性和非 线 性线 性： 浓 度不高 时 ，峰的位置不 变 ，峰的面 积 与 浓 度成正比非 线 性： 浓 度高 时 ，峰的位置偏移，面 积 不成正比16层 析的参数 2-塔板理 论
7、动 力学分析：塔板理 论1.理 论 塔板数2.柱效3.塔板高度N=5.54(V/W1/2)2H=L/NW1/2：半高 宽V：洗脱体 积17层 析的参数 2-塔板理 论柱效和流速的关系1.有一个最佳流速 2.塔板越高，效率越低 3.一般 选择 平衡 产 量位置18层 析的参数 3-动态载 量动态载 量： 制 备层 析介 质 的重要性能指 标 ，目 标 是追求更快条件下的更高 动态载 量。概念：定流速下介 质 的可用效率测 定方法：将柱移离系 统进样 冲洗系 统 至 检测讯 号平 头连 接 层 析柱继续 加 样 至 检测讯 号达平 头 数 值 的 5% 将步 骤 3， 4记 下期 间 体 积将 样
8、 品中蛋白 浓 度乘以此体 积19层 析的参数 3-动态载 量影响因素一： 介 质 孔径 孔的开放性越大， 扩 散越快， 对层 析的流速越不敏感；反之亦反 传统 介 质 随流速上升， 载 量下降迅速； 现 代介 质 随流速上升， 载量下降不明 显 绝对值 上 还 是 传统 介 质 的 载 量最高，最大 100mg/ml影响因素二： 蛋白大小 蛋白 质 越小， 扩 散速度越高，越接近平衡， 动态载 量 对 流速越不敏感。20层 析的参数 3-动态载 量影响因素三： 介 质颗 粒 介 质颗 粒越小， 载 量越高 条件允 许 的情况下尽量使用小 颗 粒影响因素四： 吸附基 团长 度 吸附基 团 排布在 线 形聚合物 长链 上，形成触手，吸附基 团 有效性增加， 载 量增加。21层 析的参数 3-动态载 量影响因素五 ：吸附 动 力学 粘度与 动态载 量 负 相关影响因素六： 上 样 条件 动态载 量 对 洗脱 剂 的离子 强 度 远 比洗脱体 积 敏感 离子 强 度增大一倍， 载 量下降不止 1倍 溶解性足 够 的条件下，上 样时 ， 盐浓 度要低，洗脱 时 可以加 浓 。
