1、单克隆抗体及应用 (monoclonal antibody, McAb or mAb),一.概述 克隆：无性繁殖的细胞株单克隆：由一个细胞无性繁殖而来的一个细胞株（一团细胞），其中所有细胞特性完全一样,（一）单克隆抗体：针对Ag分子表面某一抗原决定簇（又称表位）而产生的抗体分子，称McAb。 单克隆抗体由一个B细胞克隆产生的识别单一抗原表位的同源抗体。,（二）产生1. 1975年Kohler and Milstein首 创用杂交瘤技术成功制备McAb2.80年代初用基因工程成功制备McAb,（三）制备McAb的方法1.杂交瘤技术2.基因工程技术,二. 杂交瘤技术制备单克隆抗体,1.B细胞(浆细
2、胞）特点： 1)能产生抗体 2)但不能在体外长期培养 3)细胞内含HGPRT酶（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶）和TK酶（胸腺嘧啶核苷激酶），可通过旁路途径合成DNA 2.骨髓瘤细胞 1)能在体外长期培养 2)不含HGPRT和TK酶,3.杂交瘤细胞具有以上两种细胞的共性： 既能产生抗体、在体外能长期培养；同时含有HGPRT和TK酶，可通过旁路途径合成DNA 4.HAT培养液筛选出杂交瘤细胞 (次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶）： 氨基蝶呤是抗代谢的药物，能阻断内源性合成DNA（合成DNA的主要途径）。 那么，HAT培养液是如何选出杂交瘤细胞呢,氨甲蝶呤（叶酸拮抗剂）,阻止合成,DNA,杂交瘤细胞（含
3、HGPRT、TK),经旁路途径,合成,DNA,主要途径,B细胞、瘤细胞杂交后，经HAT培养液培养数日后，五种细胞的存活情况： （1） B细胞：自然死亡（不能在体外长期培养） （2）瘤细胞：HAT培养液（氨甲蝶呤）阻止细胞合成DNA；同时无HGPRT、TK酶，不能通过旁路途径合成DNA，故死亡 （3）B/B杂交细胞：自然死亡同（1） （4）瘤/瘤杂交细胞：死亡同（2）,（5）浆细胞/瘤细胞杂交瘤细胞：可以生长HAT培养液中氨甲蝶呤阻止 DNA合成；但其含有HGPRT、TK酶，可通过旁路途径合成DNA,（二）杂交瘤技术制备McAb的简要步骤1.制备能产生单抗的杂交瘤细胞2.克隆化杂交瘤细胞3.筛选
4、杂交瘤细胞 4.扩大培养单克隆杂交瘤细胞5. 收集单抗并鉴定6. 纯化单抗,1.制备杂交瘤细胞 （1）制备能产生McAb的小鼠脾（B）细胞: Ag免疫Balb/c小鼠 测抗体 取脾 制备脾细胞悬液 计数 （2）细胞融合：脾细胞（B)小鼠骨髓瘤细胞杂交 脾细胞(1-5107/ml): 瘤细胞（107-8/ml)融合剂：40%聚乙二醇（PEG),(3)筛选：培养过程中加入HAT培养液，培养14天，存活细胞为杂交瘤细胞。,2.鉴定：将筛选出的能产生所需抗体的杂交瘤细胞进行鉴定： 方法：检测杂交瘤细胞培养的上清液中有无目的Ab，常用ELISA、IF间接法 包被已知Ag杂交瘤细胞培养上清（Ab？）洗涤，
5、酶标羊抗鼠IgG 洗涤，底物根据显色判断有无特异Ab,3.克隆化 （1）有限稀释法：特异性杂交瘤细胞稀释：7-10个/ml,取0.1ml/孔，反复稀释培养、经ELASA间接法筛选、检测特异抗体（2）显微操作法：直接在显微镜下取单个杂交瘤细胞培养、测特异抗体 筛选和克隆化应反复交叉进行。,4.冻存或扩大培养 （1）在液氮中冻存鉴定后的杂交瘤细胞备用，需要时复苏 （2）扩大培养（增殖），可得到大量单克隆抗体体外法：将杂交瘤细胞在细胞培养瓶中进行培养、传代体内法：将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内，利用它具有瘤细胞的特点能大量繁殖，产生腹水，腹水中有大量的单抗,5.鉴定 （1） 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定单克隆
6、抗体的纯度； （2）用ELISA、免疫电泳法鉴定抗体特异性,6.纯化盐析法、离子交换层析法、凝胶过滤法、 亲和层析法任选1-2种,Ag免疫动物,ELISA间接法测定抗血清,分离脾细胞,制备骨髓瘤细胞,细胞融合,HAT,筛选杂交瘤细胞,选出产生单抗的杂交瘤细胞,反复克隆化、筛选,选出能产生单抗的单克隆杂交瘤细胞株,细胞冻存,扩大培养,单抗,分离提纯,杂交瘤技术制备单克隆抗体流程,（三）杂交瘤技术制单抗的优缺点优点：1.制备的单抗特异性高、效价高、产量高缺点：1.需特殊条件、无菌操作、难得到稳定细胞株；2.抗体为抗鼠的IgG抗体，长期用于人体不利,三.人源单克隆抗体 （一）概念：单克隆抗体为人Ig
7、G （二）制备目的：用于人,（三）杂交瘤技术制人源单抗的方法 1.人B细胞+鼠瘤细胞 杂交后不稳定 2.人B细胞+人瘤细胞 大多人瘤细胞含有HGPRT酶 3.人B细胞+人淋巴母细胞样细胞 恶性、难以获得 4.EBV转化能产生Ab的B细胞 转化过程复杂,四.基因工程制备单克隆抗体 （一）概念：在基因水平上对编码抗体的基因进行切割、拼接或修饰，甚至人工合成，然后导入受体细胞内表达而产生的抗体（单克隆抗体）。,人-鼠嵌合抗体(chimeric antibody) 重构抗体(reshaped humanized antibody) 小分子抗体:Fab片段 Fc片段 Fv片段 双特异性抗体(bispec
8、ific antibody) Ig-融合蛋白，抗体导向酶等,（二）基因工程抗体种类 1.嵌合抗体 （1）概念 用DNA 重组技术将鼠源单抗基因的可变区（V区）基因与产生人Ig的恒定区（C区）基因相连接，构成嵌合基因，导入受体细胞（骨髓瘤细胞），表达出嵌合抗体。,嵌合基因：红色 鼠McAb可变区基因；绿色人Ig的恒定区基因,嵌合抗体：可变区为鼠McAb部分，其它部分为人Ig部分,构建成功的嵌合抗体 抗乳腺癌 1986 抗结肠癌 1987 抗肺癌 1987 抗CEA（癌胚抗原） 1989 抗HBsAg 1990（我国） 抗T表面受体 BMAO31-IgG 1991（我国）,（2）嵌合抗体优点： a
9、.免疫原性低，有利于用于人体 b.在人体内半衰期较鼠单抗长 c.在人体内生物学作用（如CDC、ADCC）较鼠单抗强 d.与人/人杂交瘤比，体外传代更稳定,(3) 嵌合抗体制备流程：（不用记） a.提取能产生McAb杂交瘤细胞的DNA、RNA、mRNA b.建立基因文库：分纯轻、重链V区基因 c.测轻、重链V区基因DNA序列 d.与人Ig轻、重链C区基因及表达载体连接，构成嵌合基因 e.导入受体细胞表达，并筛选 f.产物鉴定,2.重构抗体（Reshaped Antibody) 在嵌合抗体基础上发展而来，使嵌合抗体进一步“人化”以人Ig基因为框架，去掉高变区部分，用鼠单抗高变区基因连接上，构成重构
10、基因，导入受体细胞表达出的抗体。,研究表明，Ig的氨基酸序列在重、轻链各有三个高变区（与抗原结合的部位）：重链（共450 a a）；N端3137、5168、8491 轻链（共214 a a）：N端2632、4855、9095,重构基因：绿色为人Ig基因（框架），红色为鼠McAb基因（高变区部位基因）,重构抗体：所有绿色部分均为人源，红色部分为鼠源（CDR）,红色为编码鼠单抗高变区的基因,绿色部分为 人Ig的基因,重构基因,重构抗体,重构抗体在临床应用更优于嵌合抗体。,3.单链抗体（具有结合抗原活性的单链蛋白） Single-Chain Antigen-Binding Proteins是一种新的
11、重组多肽，由一个人工设计的短多肽接头（基因）将编码轻链V区基因的C末端与编码重链V区基因的N末端相连接，然后整合到大肠杆菌基因上，表达出能特异性结合抗原的融合蛋白,N端,C端,.1988年美国Bird首次成功构建并表达了牛生长激素(BGH)的单链抗体.1989年Chaudhary构建并表达成功IL-2受体的单链抗体,单链抗体优点： 1.分子小，在血清中比McAb或Fab段清除快 2.无Fc段，免疫原性低 3.较McAb更易进入实体瘤细胞周围微循环中 4.可将多肽接头设计为具有特殊功能的位点如：金属螯合物、毒素、药物，用于影像、治疗等。,五. 单克隆抗体的应用,（一）细菌学方面 1.用于诊断用针
12、对某一细菌的单抗检测细菌抗原 2.用于研究（1）用单抗研究细菌表面抗原的成分：如用抗淋球菌脂多糖的单抗可以与脑膜炎双球菌反应，证明这两种菌的脂多糖有相同的成分（2）抗结核某些菌株的单抗可作为流行病学调查的工具,（二）病毒学方面 1.快速诊断 如肝炎、爱滋病、麻疹、流行性出血热、登革热等多种病毒感染疾病 2.病毒学研究 （1）如流感抗原的变异（神经氨酸酶改变），单抗更易确定抗原变异的部位，便于掌握变异规律，提前预报 （）疱疹病毒的快速分型,3.病毒性疾病的治疗和预防 （1）治疗 单抗用于治疗，特异性高，所需量小，减少变态反应发生。 （2）预防用单抗选择出病原微生物有效部分，有利于亚单位疫苗制备，
13、提高疫苗效果，减少其副作用,（三）肿瘤方面的应用 1.诊断 （1）用荧光标记的单抗对手术及体检标本作癌的诊断 （）用于白血病分型,2.肿瘤的治疗 （1）抗肿瘤抗原的单抗直接治疗 （2）单抗作为抗癌药物的载体，使药物准确达到靶细胞，提高局部药物浓度，减少药物对其它细胞的副作用,3.单抗在肿瘤应用中存在的问题 （1）一种肿瘤要制备相应的单抗 （2）同一肿瘤细胞抗原有差异，使用单抗有局限性 （3）肿瘤细胞抗原有调变性，局限了单抗的使用 （4）治疗有一过性 （5）鼠源单抗多次使用效果不好，并可出现超敏反应,（四）在寄生虫学方面 1.抗血吸虫单抗可用于诊断 2.抗疟原虫单抗可作为抗疟的疫苗,（五）其他方面应用 1.在器官移植中，防止移植排斥，用单抗封闭淋巴细胞受体；抗Th 细胞单抗，可抑制免疫排斥 2.用于免疫方面研究，用不同的CD单抗研究免疫细胞发生、发展、演化 3.利用单抗测定激素 4.用单抗提纯抗原（亲和层析）,思考题： 1.单克隆抗体概念 2.杂交瘤技术制备单抗的原理及简要步骤 3.HAT培养基的作用 4.人源单克隆抗体 5.基因工程抗体、嵌合抗体概念，嵌合抗体优点,
