1、前列地尔脂微球体注射液防治急性心肌梗塞再灌注后无复流的影响和机制研究,李 宪 伦 杨鹏 王勇 柯元南 卫生部中日友好医院心内科 2009年10月,内 容,研究背景 研究目的和意义 研究路线和方法 实验结果和分析 实验结论 研究展望,研 究 背 景,随着再灌注治疗技术的成熟和普及 ，再灌注治疗已使AMI患者30天的住院病死率从常规药物治疗时代的10下降至再灌注时代的5左右。其可以挽救缺血心肌，缩小梗死面积，保护心脏功能，极大改善AMI患者的预后。临床中发现，再灌注治疗也产生了新的难题和困惑。即心外膜冠状动脉再通(TIMI 3 級），心肌梗死范围仍有可能继续扩大，并且心室扩张和重构、心力衰竭以及恶
2、性心律失常等严重并发症的发生率仍较高。,现 况,无复流现象的机制,无复流现象,血小板及纤维蛋白聚集 形成微血栓,NO释放减少、ET-1生成增加 造成微循环痉挛,炎症反应 例如：白细胞聚集 中性粒细胞激活 细胞因子激活 氧自由基释放,微循环再灌注损伤,前列地尔的药理作用,前列地尔属于天然前列腺素( prostaglandin，PG) 类物质，是一种高效生物活性物质， 主要成份是11,15(S)-双羟基-9-羰基-13-反前列烯酸；前列地尔脂微球体注射液具有抑制血小板聚集、血栓素A2生成、动脉粥样脂质斑块形成及免疫复合物的作用，能扩张外周和冠脉血管； 能抑制血管平滑肌细胞的游离Ca2+，抑制交感神
3、经末梢释放去甲肾上腺素, 使血管平滑肌舒张，血管扩张；目前，临床上前列地尔主要用于血栓性脉管炎、闭塞性动脉硬化等症 。,研究目的和意义,意义：无复流作为AMI再灌注后致死的重要原因之一，是再灌注治疗过程中的一个难题。降低无复流的发生率，对改善急性心梗患者的预后具有重大的意义。,目的：通过动物心肌梗塞再灌注模型，评估前列地尔脂微球体注射液在防治无复流现象的作用，并探讨可能的分子生物学机制。,研究路线和方法,实验流程,实验猪（2025kg）,对照组（8只）,假手术组（8只）,血流动力学检测LVSP、LVEDP等指标,球囊封堵LAD远端1/31/2处120min，构建猪心梗模型，松开球囊再灌注3h,
4、静滴 生理盐水,球囊置于LAD远端1/31/2处 5h,Thioflavin-S和Evans染色心肌,分别于术前5min、AMI后120min、再灌注60 min、120min、180min,心肌声学造影（MCE）,放射免疫检测血清ET-1、IL-6、TNF-,免疫组织化学检测,前列地尔组（8只）,静滴PGE1微脂球载体,Western-blotting,再灌注180min,Real-time PCR,实 验 材 料,动物： 中华小型猪 体重223kg 购自中国农业大学药品： 前列地尔微脂球体注射液 购自北京泰德制药有限公司优维显370 注射液声学造影剂Sonovue 购自意大利博克莱公司Th
5、ioflavin-S和Evans 购自Sigma公司仪器: Phlips V5000 血管造影机Phlips iE33 心脏超声仪,实验一 前列地尔对猪急性心肌梗塞再灌注后无复流现象的防治,实验结果和分析,血液动力学检测,前列地尔能够通过减少梗塞面积，改善心功能而升高LVSP、降低LVEDP（P0.05）。,心肌声学造影（MCE）,经静脉间歇触发心肌声学造影（Trigger MCE）检查 ，应用Q-lab软件采用描迹方法 计算各区域面积比值。,各组之间危险心肌与左室面积比值均没有统计学差异（P0.05），无复流区与危险心肌面积比 具有显著统计学差异（*P0.05），前列地尔能够明显减少无复流区
6、范围。,*,#,假手术组,模型组 AMI 2h,模型组 再灌注 3h,前列地尔组 AMI 2h,前列地尔组再灌注 3h,再灌注3小时后，从左心室注入1mL/kg 4%的硫磺素（thioflavin-S），使再灌注区着色，无复流区不着色；再于原位用球囊闭塞前降支，从左心室注入Evans蓝，使正常心肌着色。 各组之间危险心肌与左室面积比值均没有统计学差异（P0.05），无复流区与危险心肌面积比 具有显著统计学差异（*P0.05），前列地尔能够明显减少无复流区范围。,硫磺素伊文思蓝染色,*,#,假手术组,模型组,前列地尔组,讨 论,模型制作,小型猪遗传稳定、冠脉结构类似人类，优于犬、鼠、猫、兔；球囊
7、栓塞减少心肌损害，优于冠脉结扎；戊巴比妥钠麻醉；呼吸机管理：呼吸频率为18次/min，潮气量为10mL/kg/次；,MCE,MCE能够反映直径100m的毛细血管灌注情况；Trigger法与Real-time法均能较好地反映无复流现象；,硫磺素S-伊文思蓝组合染色,硫磺素S通过内皮细胞染色显示畅通的血管为黄色；伊文思蓝通过与血浆蛋白结合显示正常区域为蓝色；,实验结论,经静脉心肌声学造影（MCE）可以作为评价急性心肌梗死再灌注后无复流现象的重要方法。与模型组相比较，心肌声学造影和硫磺素伊文思蓝病理染色揭示前列地尔能够缩小无复流区域面积，可能有利于防治急性心肌梗死再灌注后无复流现象的发生，改善心脏功
8、能。与模型组相比，血流动力学检测揭示前列地尔能够升高LVSP、降低LVEDP，从而改善心功能。,实验二 前列地尔对猪急性心肌梗塞再灌注后微循环黏附分子的研究,实验材料,动物及模型制作： 同实验一药品： 125I TNF-放免分析试剂盒 解放军301医院东亚放免中心125I IL-6放免分析试剂盒 解放军301医院东亚放免中心SYBR-Green PCR试剂盒 TaKaRa公司鼠抗猪整合素-1 BD Bioscience公司鼠抗猪PECAM-1抗体 abCom 公司仪器: Rotor-gene 3000 PCR 仪SH-682型放射免疫计数器,血清学检测,通过放射免疫检测，与模型组相比，前列地尔
9、组可以降低IL-6和TNF-的血清浓度(P0.05)。,实验结果与分析,相对定量Real-time PCR检测,利用SYBR-Green法检测正常区、再灌区、无复流区心肌组织CD29、E-selectin、P-selectin、VCAM-1等粘附分子mRNA水平表达情况的变化 。以管家基因-actin为对照，采用双标准曲线的方法计算各区心肌mRNA相对浓度。相对浓度表示各心肌组织样本的待测因子mRNA浓度相对于对照组正常区待测因子mRNA浓度的倍数。（*P0.05）,*,*,#,*,*,#,病理切片免疫组化染色,整合素-1（CD29）（200）,假手术组,模型组正常区,模型组再灌区,模型组无复
10、流区,前列地尔组再灌区,前列地尔组无复流区,*,*,按照顺时针方向选择6个400视野，使用软件IPP6.0对整合素-1（CD29）在各组各区域阳性表达量进行定量测量和分析。各组各区域阳性表达产物的平均光密度（即积分光密度与所占面积的比值，IOD/Area）如图所示。与模型组相比，前列地尔能够明显抑制无复流区和再灌区整合素-1的蛋白表达（*P0.05）。,#,#,血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1（CD31）（200）,假手术组,模型组正常区,模型组再灌区,模型组无复流区,前列地尔组再灌区,前列地尔组无复流区,*,*,按照顺时针方向选择6个400视野，使用软件IPP6.0对血小板内皮细胞粘附分
11、子PECAM-1（CD31）在各组各区域阳性表达量进行定量测量和分析。各组各区域阳性表达产物的平均光密度（即积分光密度与所占面积的比值，IOD/Area）如图。与模型组相比，前列地尔能够明显抑制无复流区血小板内皮细胞粘附分子CD31的蛋白表达（*P0.05）。,#,#,假手术组（400）,病理切片HE染色,假手术组（200）,模型组正常区（200）,模型组正常区（400）,模型组再灌区（200）,模型组再灌区（400）,模型组无复流区（400）,模型组无复流区（200）,前列地尔组正常区（200）,前列地尔组再灌区（200）,前列地尔组无复流区（200）,前列地尔组正常区（400）,前列地尔组
12、再灌区（400）,前列地尔组无复流区（400）,各组HE染色切片按顺时针顺序随机选取6个400视野进行拍照，利用Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件计数HE染色切片血管周围浸润的炎性细胞，其中淋巴细胞形态为小而圆，中性粒细胞内可见多型分叶核。较模型组，前列地尔能够明显抑制白细胞的浸润（*P0.05）。,*,*,#,#,讨 论,IL-6,TNF-,VCAM-1,PECAM-1,P-selectin,E-selectin,Integrin-1,与模型组相比，前列地尔可以降低IL-6、TNF-等炎症反应上游刺激因子的血清浓度。前列地尔通过抑制粘附分子（整合素-1、E-选择素、P-选择素
13、、VCAM-1）的mRNA表达以及整合素-1、PECAM-1的蛋白表达，阻碍了白细胞与内皮细胞之间的粘附、聚集，减轻了缺血再灌注对心肌微循环的损伤。与模型组相比，在降低整合素-1、E-选择素、P-选择素、VCAM-1 mRNA的浓度上，前列地尔具有统计学显著差异（P0.01）。,实验结论,实验三 前列地尔对猪急性心肌梗塞再灌注后微血管内皮细胞功能的研究,实验材料,动物及模型制作： 同实验一药品： SYBR-Green PCR试剂盒 TaKaRa公司鼠抗猪PDGF-R抗体 Sigma 公司鼠抗猪VEGF抗体 ABR公司兔抗猪eNOS抗体 ABR公司仪器: Rotor-gene 3000 PCR
14、仪SH-682型放射免疫计数器Mini-Cell 制胶系统,血清学检测,通过放射免疫法检测，与模型组相比，前列地尔组可以降低ET-1的血清浓度(P0.05)。,实验结果与分析,相对定量Real-time PCR检测,利用SYBR-Green法检测正常区、再灌区、无复流区心肌组织GM-CSF、PDGF、eNOS、VEGF等因子mRNA水平表达情况的变化 。以管家基因-actin为对照，采用双标准曲线的方法计算各区心肌mRNA相对浓度。相对浓度表示各心肌组织样本的待测因子mRNA浓度相对于对照组正常区待测因子mRNA浓度的倍数。（*P0.05）,*,*,*,*,#,#,*,#,*,*,#,#,血小
15、板衍化生长因子受体 PDGF-R（200）,假手术组,模型组正常区,模型组再灌区,模型组无复流区,前列地尔组再灌区,前列地尔组无复流区,按照顺时针方向选择6个400视野，使用软件IPP6.0对血小板衍化生长因子受体（PDGF-R）在各组各区域阳性表达量进行定量测量和分析。各组各区域阳性表达产物的平均光密度（即积分光密度与所占面积的比值，IOD/Area）如图所示。与模型组相比，前列地尔能够明显抑制无复流区和再灌区PDGF-R的蛋白表达（*P0.05 ）。,*,*,#,血管内皮生长因子（VEGF，200）,假手术组,模型组正常区,模型组再灌区,模型组无复流区,*,*,前列地尔组再灌区,前列地尔组
16、无复流区,按照顺时针方向选择6个400视野，使用软件IPP6.0对血管内皮生长因子受体（VEGF）在各组各区域阳性表达量进行定量测量和分析。各组各区域阳性表达产物的平均光密度（即积分光密度与所占面积的比值，IOD/Area）如图所示。与模型组相比，前列地尔能够明显促进无复流区和再灌区VEGF的蛋白表达（*P0.05 ）。,#,*,eNOS、VEGF的Western blotting 检测结果图其中1、2、3分别为模型组的正常区、再灌区、无复流区，4、5、6分别为前列地尔组的正常区、再灌区、无复流区,Western-blotting检测,VEGF,经过软件IPP6.0计算eNOS、VEGF与管家
17、蛋白Elf的灰度比值。与模型组相比，前列地尔能促进无复流区心肌组织一氧化氮合酶、血管生长因子的蛋白表达，并具有显著的统计学差异（*P0.05 ，*P0.01）。,*,*,*,*,*,eNOS,1 2 3,4 5 6,1 2 3,4 5 6,讨 论,前列地尔,内皮细胞,降低血清内皮素ET-1，舒张血管,促进 eNOS mRNA和蛋白表达，产生NO，舒张血管,抑制 GM-CSF mRNA表达，减少白细胞聚集,抑制 PDGF mRNA表达和PDGF-R蛋白表达，减少血小板聚集,促进 VEGF mRNA和蛋白表达，修复内皮损伤,前列地尔可以降低内皮素ET-1的血清浓度，提高内皮型一氧化氮合酶eNOS的
18、mRNA和蛋白质表达，起到扩张血管的作用，改善心脏功能。前列地尔可以抑制血小板衍化生长因子（PDGF）及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的mRNA表达及PDGF受体蛋白表达，促进血管内皮生长因子（VEGF）的mRNA和蛋白质表达，改善微循环灌注。与模型组相比，前列地尔在促进血管内皮生长因子（VEGF）及一氧化氮合酶（eNOS）的mRNA和蛋白质表达上具有统计学差异（P0.05）。,实验结论,总 结,正常心肌微血管内状态,缺血/再灌时心肌微血管内状态,用药后心肌微血管内状态,研 究 展 望,本课题组将在此动物实验的基础上，进一步争取资助并继续前列地尔脂微球体注射液在防治急性冠脉综合症PCI术后无复流现象的临床研究。通过随机双盲静滴前列地尔脂微球体注射液，结合心肌声学造影、血清学ELESA检测和Real-time PCR实验研究患者无复流现象的防治和改善情况，并对患者进行近中期随访，观察MACCE发生率。,感谢各位专家的聆听和指导！,谢谢！,
