1、第四章 病毒抗原与抗体检测技术,预防医学实验中心 柏桦,一、抗原抗体反应,特异性高 可逆 氢键、范德华力、静电吸引力 可见 抗原-抗体比例适宜，复合物相成团,二、影响反应的因素,电解质 pH7时，适当电解质使其结合可见凝集团或沉淀 温度 37 温度升高，反应加快 56 酸碱度 pH68 接近等电点时易出现假阳性,第一节 免疫荧光技术,Immunofluorescence assay IFA 能解决：是什么 在哪里 有多少 荧光 激发光谱 发射光谱 荧光效率 荧光寿命 荧光猝灭 荧光偏振,第一节 免疫荧光技术,荧光物质,二、免疫荧光试验,（一）原理 用荧光标记物标记病毒抗原或抗体，作为分子探针，
2、检查细胞或组织内相应的病毒抗体或抗原。荧光标记物受激发光照射后发光，用荧光显微镜观察，可确定病毒种类、定位、定量。,二、免疫荧光试验,1.制作病毒染色标本 培养敏感细胞（细胞爬片） 种毒 固定、干燥 丙酮,二、免疫荧光试验,1.制作病毒染色标本临床样本（非固型组织） 涂片 固定、干燥,二、免疫荧光试验,1.制作病毒染色标本尸检样品（35mm） 脱水脱色 冰冻切片 印片 石蜡固定、脱蜡 丙酮固定、干燥,二、免疫荧光试验,2.荧光抗体制备 制备抗体 用高纯度病毒免疫动物获取血清，分离IgG，提纯家兔、绵羊、山羊高特异性 高亲和力,二、免疫荧光试验,2.荧光抗体制备 标记荧光素 共价键结合 抗体+荧
3、光素4持续搅拌数小时 纯化（离心、透析、过滤）,二、免疫荧光试验,3.鉴定制成的荧光抗体 以FITC为例 荧光（F）蛋白（P）结合率 调整制备液至A280mm=12.87A495mmA280mm-0.35A495mm 比值越大，抗体结合荧光素越多,F/P=,二、免疫荧光试验,3.鉴定制成的荧光抗体 测定抗体效价：双向免疫扩散试验 抗体特异性：吸收试验、抑制试验 抗体特异性染色滴度：倍比稀释,二、免疫荧光试验,4.荧光抗体染色 直接法,二、免疫荧光试验,4.荧光抗体染色 间接法,二、免疫荧光试验,4.荧光抗体染色 补体法 荧光标记抗补体抗体 双标记法 两种荧光素抗体检测两种抗原,二、免疫荧光试验
4、,5.设立对照 区分特异性和非特异性染色 标本自发荧光对照 荧光抗体对照 阳性抗原对照 阻断试验,三、免疫荧光显微镜技术,荧光显微镜 利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。,三、免疫荧光显微镜技术,光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 滤光片：隔热、激发和吸收滤光片 光路：透射光、落射光 聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器 镜头：消色差镜头,三、免疫荧光显微镜技术,透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。,落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。,四、时间分辩免疫荧光技术,Time-resolv
5、ed fluoroimmunoassay TR-FIA （一）原理 自发荧光寿命短:1ns10ns 镧系元素寿命长:10s1000s,短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光 铕Ed3+ 锝Tb3+ 钐Sm3+ 镝Dy3+,四、时间分辩免疫荧光技术,（二）方法类型 双抗体夹心法,固相抗体和Eu3+标记抗体与待检抗原结合，形成固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物，酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发射613nm荧光。,四、时间分辩免疫荧光技术,（二）方法类型 固相抗体竞争法待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与
6、待检抗原含量成反比。 固相抗原竞争法待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。,第二节 酶免疫技术,Enzyme immunoassay抗原抗体反应特异性 酶高效催化反应专一性,第二节 酶免疫技术,第二节 酶免疫技术,酶标记 戊二醛交联法过碘酸氧化法,醛基,酶,蛋白质,HRP,过碘酸盐,HRP,醛基,第二节 酶免疫技术,固相载体 塑料制品 微粒 膜载体 NC膜、尼龙膜,第二节 酶免疫技术,包被与封闭 包被 适宜浓度蛋白质 封闭 二次包被填补空隙 小牛血清,二、酶联免疫吸附试验,Enzyme-linked im
7、munosorbent assay ELISA 酶标记抗体（抗原）与待测抗原（抗体）发生特异性反应，加入酶底物，通过酶对底物的显色反应，对待测抗原（抗体）进行定位、定性或定量分析。,间接法,检测抗体,双抗体夹心法,检测抗原,竞争法,可检测抗原、抗体,捕获法,检测IgM抗体,+,三、免疫酶染色试验,Immunoenzymatic staining test IEST酶标抗体（抗原）抗原（抗体）复合物底物有色底物,三、免疫酶染色试验,细胞免疫酶染色 均相酶免疫测定无需分离游离与结合的酶标记物 酶标记物结合后改变酶活性 非均相酶免疫测定需分离游离与结合的酶标记物 液相：用二抗或沉淀去除游离酶标记物
8、固相：ELISA,第三节 放射免疫技术,Radioimmunoassay RIA 利用放射性核素灵敏精确性与抗原抗体反应特异性相结合进行定量分析 放射免疫 核素标记抗原与未标记抗原竞争性结合特异性抗体 免疫放射 核素标记抗体结合待测抗原,R.S. Yalow,第三节 放射免疫技术,125I、131I、3H、14C 标记 纯化 鉴定 放射性 免疫活性,第三节 放射免疫技术,第三节 放射免疫技术,放射免疫 竞争法,+,+,+,+,+,+,+,+,Bound,Free,Ag,Ab,6/8=0.75,4/8=0.5,2/8=0.25,1/8=0.125,B/B+F,第三节 放射免疫技术,放射免疫,以未
9、结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F或B/(BF)与Ag的量变存在着函数关系剂量反应 曲线,第四节 血清学试验,中和试验 血凝/血凝抑制试验 补体结合试验,一、中和试验,neutralization test体外将病毒与特异性抗体混合并发生反应，再将混合物接种至敏感的宿主体内，然后测定残存病毒感染力的方法。中和抗体,一、中和试验,（一）原理 中和抗体存在使病毒不能吸附和穿入宿主细胞，使病毒失去感染力。 当病毒与抗体混合后，接种敏感宿主细胞再观察敏感宿主的情况，即观察残存的病毒对宿主的感染力。,一、中和试验,（二）方法步骤 病毒-已知滴度，并有感染力 测滴度：细胞培养，将病毒10倍稀
10、释接种敏感细胞或动物，观察CPE或动物感染情况，确定滴定终点以CCID50或LD50表示 标准病毒试验浓度：100 CCID50/单位体积或100 LD50/单位体积,一、中和试验,抗体 用细胞培养法测病毒抗体的滴度：将倍比稀释的病毒抗血清液与等量的标准病毒液混合，接种敏感细胞，观察CPE。 病毒抗体滴度的确定：抗血清保护细胞免受病毒感染的最高稀释倍数的倒数。 抗体滴度的含义：抑制CPE的最高稀释倍数的抗血清中，每单位体积含一个抗体单位。,一、中和试验,举例 如观察结果是1：10至1：320抗血清均能抑制病毒的CPE，也就是当抗血清稀释到320倍时，0.1ml抗血清含有1个抗体单位。 请问：
11、1：160及1：40含有几个抗体单位？ 标准抗体浓度为20个抗体单位/0.1ml,一、中和试验,宿主 细胞培养:观察CPE和空斑（最理想和常用） 鸡胚：观察鸡胚的死亡（流感）、绒毛尿囊腔上痘疮及血凝现象（天花、牛痘、HSV） 动物（小白鼠）:成年和幼鼠易感，如乙脑病毒、森林脑炎病毒,一、中和试验,（二）方法步骤 固定血清稀释抗病毒法 检测病毒及其滴度 固定病毒稀释抗血清法 检测血清效价,一、中和试验,（二）方法步骤 固定血清稀释病毒法用中和试验方法鉴定病毒时，将不同稀释倍数的病毒与标准的抗血清(20个抗体单位/单位体积)混合、孵育，使二者充分反应，然后将混合液接种到敏感宿主体内，观察试验结果。
12、,固定血清稀释病毒法,试验材料 宿主:敏感细胞和动物、鸡胚 标准抗病毒血清(20个抗体单位/0.1ml) 病毒分离物 试验步骤 不同浓度病毒液与等量的抗病毒血清混合细胞培养液倍比稀释病毒 不同浓度病毒液与等量阴性血清混合 接种细胞, 设正常细胞对照，CO2孵箱观察CPE 中和试验病毒CCID50：当抗血清组的CCID50与阴性组之差的对数大于2,才说明中和试验阳性。,固定血清稀释病毒法,阴性血清病毒CCID50的计算,固定血清稀释病毒法,距离比例（大于50%的CPE阳性率50%）/（大于50%的CPE阳性率小于50%的CPE阳性率）（8350）/（8317）0.5lgCCID50=大于50%的
13、CPE阳性率血清稀释度的对数+距离比例稀释系数的对数=lg10-5+0.5 lg0.1=-5.5,其反对数是10-5.5.阴性血清组的病毒CCID50为10-5.5/0.1ml。,固定血清稀释病毒法,阳性血清病毒CCID50的计算,固定血清稀释病毒法,距离比例（大于50%的CPE阳性率50%）/（大于50%的CPE 阳性率小于50%的CPE阳性率）（7150）/（7129）0.5 大于50%的CPE阳性率血清稀释度的对数+距离比例稀释系数的对数=lg10-3+0.5 lg0.1=-3.5,其反对数是10-3.5。 阳性血清组的病毒CCID50为10-3.5/0.1ml。因抗血清组的CCID50
14、为10-3.5，阴性血清组的病毒CCID50为10-5.5,所以10-3.5-10-5.5=2,表明分离的病毒是与中和抗体相对应的病毒。,一、中和试验,（二）方法步骤 固定病毒稀释血清法用于血清抗体滴度的测量。用已知病毒检测位置抗体滴度。100 CCID50/单位体积的病毒+连续倍比稀释血清 孵育1h 接种敏感宿主 观察不同稀释度的血清保护宿主感染病毒的情况,固定病毒稀释血清法,试验材料: 敏感宿主 标准滴定的病毒100CCID50/0.1ml 急性期或恢复期血清 试验步骤 细胞培养液倍比稀释急性或恢复期血清 取不同稀释浓度血清与标准病毒混合并37孵育1h 取混合液0.2ml接种细胞,CO2孵
15、箱观察CPE 50血清中和终点：50%细胞不产生细胞病变的血清稀释度,固定病毒稀释血清法,恢复期血清中和病毒的结果,固定病毒稀释血清法,距离比例（50%小于50%的CPE阳性率）/ （大于50%的CPE阳性率小于50%的CPE阳性率） （5020）/（8020）0.5 50%血清中和终点的范围:1:32与1:64之间。 中和终点浓度=小于50%的CPE阳性率血清稀释度的对数+距离比例稀释系数的对数=lg10-1.5+0.5 lg0.5=-1.65,其反对数是1/45 即50%血清中和终点为1:45含义：1:45稀释度的恢复期血清可保护50%细胞不产生细胞病变效应。,二、血凝/血抑,血凝 HA,
16、血凝抑制 HI,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12,血凝试验 HA,试验方法 选择96孔板（V型） 病毒液倍比稀释 稀释好后加鸡红细胞 混匀后20室温静置30min,+50l PBS,吸出一半,1:2,1:22,1:23,1:24,+100l 病毒液,+50l 鸡红细胞,吸弃一半,血凝试验 HA,血凝滴度：以出现+的稀释度的倒数为判定终点,为1个血凝单位。凝集效价：能使血球产生+凝集的病毒最高稀释度为病毒的凝集效价，即0.5ml病毒液含1个血凝单位。,三、补体结合试验,补体：正常人和动物血清与组织液中的一组经活化后具有酶活性的蛋白质，辅助抗体介导免疫溶菌和溶血作用。对热不稳定
17、。 绵羊红细胞与抗绵羊红细胞抗体（溶血素）作用形成溶血素致敏的绵羊红细胞。补体可使这种致敏红细胞溶解。 补体可结合任何病毒抗原抗体复合物,三、补体结合试验,如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性。,三、补体结合试验,有3个系统： 反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）； 补体系统； 指示系统，即SRBC与相应溶血素，形成致敏红细胞。,三、补体结合试验,病毒抗原 从组织培养
18、、鸡胚和动物试验中获得病毒抗原 应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强 如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应,三、补体结合试验,抗体 免疫用的病毒抗原最好不是同一细胞或动物，以免发生交叉反应 血清样品应加热灭活处理，消除补体活性和非特异性抗补体活性 人和豚鼠灭活温度为56；家兔和马灭活温度为65,三、补体结合试验,补体 检测人和哺乳动物血清应用豚鼠新鲜血清补体 临用前使用 1SRBC制备 绵羊颈静脉采血，生理盐水洗涤 溶血素 用绵羊红细胞免疫家兔获得 效价达到1:4000可获得 5630分钟灭活，加甘油后长期保存 稀释液 含钙镁
19、离子的生理盐水，可维持补体的稳定,三、补体结合试验,溶血素的滴定 先将溶血素稀释成1:1001:1000,再依次加入溶血素0.1ml，钙镁盐水0.2ml，1:60补体0.2ml、1绵羊红细胞0.1ml，混匀后再水浴 结果判定：完全溶血的试管液体红色透明，离心后见少许细胞;不溶血的试管液体混浊，放置后见红细胞沉淀，上清无色透明 溶血素效价的测定;以完全溶血的最高稀释倍数确定为1个单位 本例1个单位的溶血素的效价为1：4000；正式使用2个单位,三、补体结合试验,补体的滴定 补体不稳定，每次试验前需滴定,三、补体结合试验,确实单位（exact unit） 将完全溶血的最小补体量，如上图1：60补体
20、最小量0.12ml可产生完全溶血，为1个确实单位. 正式试验时使用2个确实单位。（20.12):60=0.2:x 得X=50,即实际应用中的2个补体确实单位为1:50的补体0.2ml. 抗原和抗体的滴定 找出抗原和抗体最佳比例,用方阵滴定法,注：4-为完全不溶血；3为25%羊红细胞溶血；2为50羊红细胞 溶血；1为75%羊红细胞溶血；0为完全溶血,三、补体结合试验,将抗原和抗体进行倍比稀释（1：81：512)横向前7排加不同稀释度的抗原0.1ml;纵向前7排加不同稀释度的抗血清溶液0.1ml; 各管加含两个确实单位的补体0.2ml; 最好4度冰箱过夜; 最后加致敏SRBC; 结果判定 选择抗原
21、和抗体呈强阳性反应(完全不溶血)的最高稀释度作为抗体的效价; 由图可知1:64的抗原和1:32的抗血清分别为1U; 正式试验中抗原一般用24U(1:321:16)，抗血清用4U(1:8),三、补体结合试验,按图序加入各种试剂； 阴性和阳性对照代表溶血和不溶血； 补体对照管中2U应全溶;若不完全溶血表明补体量不够； 补体0.5U应不溶,若完全溶血则表明补体含量过多。 注意事项 抗原和抗体纯度和滴度要够； 补体保存应低温保存,不要反复冻溶； 补体含量常用0.52U。,小结,免疫荧光、酶联免疫、放射免疫、中和试验、血凝/血抑试验的原理 免疫荧光、酶联免疫、放射免疫、中和试验、血凝/血抑试验的类型与方法步骤,
