1、异丙酚通过激活 ERK 信号通路减少 H2O2 引起的 L02 肝细胞凋亡王浩 薛张纲复旦大学附属中山医院麻醉科，上海 200032Propofol protected hepatic L02 cells from H2O2-induced apoptosis via activation of Extracellular Signal-Regulated Kinases (ERK) PathwayWANG Hao, XUE Zhang-gangDepartment of Anesthesiology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shangha
2、i 200032, China摘要：目的 已有报道证明异丙酚在缺血再灌注损伤 (ischemia/reperfusion I/R) 中对一些重要脏器具有保护作用，但是对肝细胞的作用报道甚少。此外，最近的研究显示 ERK 信号通路在氧化应激中发挥重要作用。因此我们用 H2O2 诱导肝细胞氧化损伤，观察异丙酚预处理对人 L02 细胞的影响并且进一步检测 ERK通路在其中的作用。方法 L02 细胞经异丙酚预处理后被 H2O2 诱导凋亡，用TUNEL 法及 Caspase-3 切割程度来检测细胞的凋亡。用蛋白质印迹技术检测ERK 及 MEK 的磷酸化情况。通过实时定量 PCR 技术检测 Bcl-2,
3、Bcl-xL, Bad, 和 Bax mRNA 表达量变化。结果 在 H2O2 诱导的凋亡过程中，经异丙酚预处理的 L02 细胞凋亡数量及 Caspase-3 切割量均明显减少。并且这种减少与异丙酚的剂量成正相关：当异丙酚剂量用至 300 M时，细胞的凋亡程度被降至最低。与此一致的是 ERK 的磷酸化被显著的激活。单用不同浓度的异丙酚 (10 - 300 M) 处理细胞，检测到浓度依赖性的 ERK 及 MEK 磷酸化升高。不同时间点（0 - 4 h）收获经异丙酚处理的细胞，发现 ERK 及 MEK 在 0.5 小时内就可以被激活，随后逐渐降低，至 4 h 时，ERK 及 MEK 的活性下降到峰
4、值时的一半。用特异性的 MEK 抑制剂 PD98059 处理细胞完全抑制异丙酚诱导的 ERK 活性，并且加重了细胞的凋亡程度。异丙酚预处理减少了促凋亡基因 Bad 和 Bax 的mRNA 表达，并且这种抑制作用可以被 PD98059 逆转。结论 我们的研究提示异丙酚对 H2O2 诱导的人肝细胞凋亡具有保护作用，并且这种保护作用至少部分是通过激活 ERK 信号通路进而抑制 Bad 和 Bax 的表达起作用的。关键词 ：异丙酚；肝细胞；ERK；凋亡Abstract： Objective Here we investigated the effect of propofol precondition
5、ing on human hepatic L02 cells under hydrogen peroxide (H2O2)-induced oxidative stress and attempted to find out whether ERK pathway is involved in this process. Methods Preconditioned or nonpreconditioned human hepatic L02 cells were exposed to H2O2 and the changes of apoptosis were evaluated by TU
6、NEL assay and Caspase-3 cleavage. Activation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) and MAP Kinase/ERK Kinase 1/2 (MEK1/2) was measured by western blot. The mRNA expression of Bcl-2, Bcl-xL, Bad, and Bax was quantified by real-time PCR. Results Propofol preconditioning reduced populat
7、ion of apoptotic cells and Caspase-3 cleavage induced by H2O2 in hepatic L02 cells. The minimal amount of cell death was relevant to 300 M propofol pretreatment, accompanying with significant activation of ERK1/2. L02 cells treated with propofol (10 - 300 M) alone, led to a dose-dependent activation
8、 of ERK and MEK. Treated cells with 300 M propofol for 0 - 4 h, ERK and MEK were activated within 0.5 h and eventually declined to less than 50% at 4 h. The addition of specific inhibitor, PD98059, completely abolished the activation of ERK and aggravated the extent of apoptosis. Propofol pretreatme
9、nt decreased the mRNA expression of pro-apoptotic genes, and this repression could be reversed by PD98059. Conclusion These findings present a new molecular mechanism of propofol protection against H2O2-induced apoptosis in hepatocytes, which is at least partly mediated by activating MEK-ERK pathway
10、, and further suppressing Bad and Bax expression.Key words：Propofol; hepaocytes; ERK; Apoptosis肝脏移植、组织切除术及出血性休克都会引起细胞氧化损伤并最终导致肝功能失调或衰竭 1, 2。组织缺血再灌注中堆积的氧自由基是导致细胞死亡的主要因素 3, 4。目前针对 I/R 损伤最有效的措施是预处理，如：缺血预处理、热休克及一些模仿这种作用的药物，都可以有效的提高移植术后的肝组织存活率 5, 6。作为常用的静脉麻醉药，异丙酚由于它的代谢几乎不受到肝功能失调的影响，因此常用于肝移植手术中。最近的一系列报道都提
11、示异丙酚作为抗氧化剂对心、肺、脑具有保护作用 7, 8, 9。但是对不同的组织细胞以及在不同的实验条件下，异丙酚的作用则并不完全一致。到目前为止，异丙酚对肝细胞在氧化应激条件下的作用尚不清楚，并且其作用的分子机制更是知之甚少。氧化应激产物(Reactive oxygen species, ROS)包括过氧化氢(Hydrogen peroxide, H2O2)是由于在 I/R 异常代谢过程中堆积的产物。细胞内毒性 H2O2 的堆积常伴随着细胞内一些组分的快速修饰，如细胞内谷胱甘肽和 ATP 的削减、NAD+的下降、胞内钙离子的增多以及脂质的过氧化。这会引起细胞的凋亡和坏死。凋亡是一种主动的细胞程
12、序性死亡过程，其主要特征是细胞皱缩、染色体固缩成团形成凋亡小体和活性 Caspase-3 的切割 10。有丝分裂激酶蛋白家族 (Mitogen-actived protein kinases, MAPKs) 被认为涉及细胞氧化应激的过程。在真核细胞生物中，MAPKs 将细胞外的信号传递到细胞核 11, 12, 13。ERK 是MAPKs 家族成员之一，很多实验证实它在氧化损伤中具有保护组织脏器的作用。ERK 磷酸化激活后与下游的转录因子及其他激酶相互作用，调节细胞内部的生理功能 14, 15, 16。尽管 ERK 被报道参与缺血损伤的病理过程，但是在异丙酚对肝细胞的预处理中的效应未见报道。在本
13、研究中，我们检测了异丙酚预处理对于 H2O2 诱导肝细胞凋亡的作用，并且检测了异丙酚对 ERK 通路的影响。材料方法细胞株及主要试剂 L02 人肝细胞购自中国科学院细胞生化所。RPMI-1640 培养液及胎牛血清购自 GIBCO 公司。抗人 ERK 及磷酸化 ERK 单克隆抗体，兔抗人 Caspase-3、MEK1/2、磷酸化 MEK1/2 多克隆抗体均购自 CST 公司。ECL 发光试剂购自 Pierce 公司。异丙酚（得普利麻）购自阿斯利康公司。TUNEL 试剂盒购自 Roche 公司。Real-Time PCR 试剂盒购自 TaKaRa 公司。细胞培养 L02 人肝细胞培养于 37oC、
14、5CO 2 及饱和湿度的细胞培养箱中。细胞在含有 10的胎牛血清的 RPMI-1640 培养液（含链霉素与青霉素）中贴壁生长。异丙酚及抑制剂预处理 为了检测不同浓度异丙酚预处理的作用，将异丙酚溶解在 DMSO 中，加入细胞培养液中的终浓度为 0，50，100 和 300 M。L02 细胞接种到 3.5 cm 的培养皿，当细胞贴壁生长 1 d 后，分别加入不同浓度的异丙酚预处理 1 h，对照细胞则加入相同体积的 DMSO，然后加入 H2O2 诱导细胞凋亡。作为溶剂的 DMSO 在各样品中的终浓度均低于 0.3。预处理后的细胞，继续用 200M的 H2O2 共通孵育 8h 诱导凋亡 17。为了测定
15、异丙酚是否通过激活EKR 信号通路发挥抗凋亡作用，在加入 H2O2 诱导凋亡前，L02 细胞先用PD98059（特异性 MEK 抑制剂）处理 1h，然后再异丙酚预处理。原位细胞凋亡检测（TUNEL） 用 4中性多聚甲醛室温固定生长于 96 孔板中的细胞 1 h，0.1mol/L PBS 洗涤 2 遍（每次 5min）后加入含 0.3%H2O2 的甲醇中 1 h，后用含 0.1% Tween-20 的 PBS 洗涤 2 遍，每个孔加入 50 l TUNEL 反应液，37 h 孵育 1 h 后在荧光显微镜下观察拍照。Western 印迹技术 收集细胞，PBS 洗涤细胞两次，加细胞裂解液，超声破碎细
16、胞，用 Lowry 法测定蛋白浓度。SDS-PAGE 电泳分离细胞总蛋白，每孔上样量为 50 g，然后将胶上的蛋白通过电转移印迹到 PVDF 膜上。5 脱脂奶粉/TBS 液封闭 PVDF 膜，加 ERK、MEK、Caspase-3 或 -tubulin 一抗结合，然后用 HRP 标记的山羊抗兔或抗鼠 IgG 二抗结合，最后用 ECL 试剂发光，X 胶片曝光、显影、定影记录条带，将条带扫描后进行灰度分析。Real-Time RT-PCR 定量分析 用 Real-Time RT-PCR 检测 Bcl-2 家族基因的表达水平（仪器型号为 ABI Prism 7300） 。用 Trizol 试剂抽提细
17、胞总 RNA，取 2g RNA 逆转录制备 cDNA。Real-Time PCR 反应体系包括 2 l的 cDNA 模板（1的 RT 产物） 、10 l SYBR Green Mix（Takara）及 10 M终浓度的上、下游引物（序列见表 1） ，加入 H2O 补足 20 l，扩增条件为 95 C 5 s 总变性以及 95 C 5 s、 60 C 31 s 循环 40 次。目的基因的 mRNA 水平用 Gapdh 内参校正，并将对照组细胞的表达水平设定为 1。所有样品每个基因的 PCR 反应均为 3 孔，实验重复至少 3 次。统计学处理 采用 SPSS11.5 统计软件，最终数据采用“均数标
18、准差”表示，数据比较采用 t 检验，P 0.05 认为差异有统计学意义。结果异丙酚保护 L02 细胞对抗 H2O2 诱导的凋亡首先，我们用 TUNEL 法测定发现异丙酚预处理过的细胞的凋亡细胞数量与对照细胞相比有不同程度的减少，并且与异丙酚的浓度呈正相关（见图 1A） 。对照细胞 100的凋亡，而用 300 M预处理的细胞只有 32发生凋亡（见图1B） 。蛋白质印迹技术也证明 300 M的异丙酚显著的降低了 Caspase-3 的切割（见图 1C-D） 。因此，我们的体外实验提示异丙酚在肝细胞中的作用与在心、脑细胞中的作用一致，都是起了保护细胞抗凋亡的作用。异丙酚激活 ERK 信号通路由于异丙
19、酚调节细胞效应的分子机制研究的不多，而 ERK 信号通路被认为涉及氧化应激过程的抗凋亡作用。因此，我们想检测异丙酚是否与 ERK 信号通路存在联系。如图 2A-B 所示，200 M的 H2O2 本身不能激活 ERK 的磷酸化，而加入 300 M的异丙酚明显上调了磷酸化的 ERK，这说明 ERK 的激活完全依赖于异丙酚的作用。考虑到异丙酚可以激活 ERK，我们进一步分析了异丙酚对ERK 及其上游 MEK 激活的时间和剂量效应关系。分别用 10，50，100，300 M的异丙酚处理细胞 1 h，发现 ERK 的活性与异丙酚的浓度呈正相关（见图3A-C） 。用 300 M的异丙酚处理细胞后分别在 0
20、、0.5、1、2 和 4 h 收获细胞，发现在 0.5 h 内 ERK 就被激活，当到 4 h 时， ERK 的活性降低到峰值时的50（见图 3D-F） 。因此，我们的结果提示异丙酚在 H2O2 诱导的凋亡中可能通过激活 ERK 信号通路发挥保护细胞的作用。阻断 ERK 的活性抑制了异丙酚的保护作用为了证实异丙酚对 ERK 的活性调节作用，我们用 50 M PD98059（MEK的特异性抑制剂）孵育细胞 1h，发现 ERK 的活性几乎完全被阻断（见图 4A-B） 。TUNEL 染色和 Caspase-3 活性分析都发现使用抑制剂的细胞凋亡程度明显高于未使用抑制剂的细胞（见图 C-F） 。因此，
21、进一步证实异丙酚通过调节 ERK信号通路发挥抗凋亡作用的。异丙酚对 Bad 和 Bax 表达的调节由于 Bcl-2 家族基因与细胞的凋亡密切相关，我们检测了异丙酚作用下 Bcl-2 家族基因表达的变化是否依赖于 ERK 信号的调节。用 Real-Time PCR 的方法定量分析了 Bad 和 Bax 两个促凋亡基因及 Bcl-xL 和 Bcl-2 两个抗凋亡基因的mRNA 变化。我们发现 Bad 和 Bax 的表达明显减少，而 Bcl-xL 和 Bcl-2 的表达没有显著差异（见图 5A-B） 。用 PD98059 处理后， Bad 和 Bax 的降低被大量抑制（见图 5C） ，揭示 Bad
22、和 Bax 表达的调控受到异丙酚ERK 信号通路的影响。讨论本研究的目的主要是为了阐述异丙酚在氧化应激条件下对肝细胞的影响。这里所有的数据都强烈的提示异丙酚对 L02 人肝细胞具有保护作用，并且这种作用至少部分是通过激活 MEK-ERK 信号通路进而抑制特异性的促凋亡基因的表达起作用的。为了证明异丙酚的抗凋亡作用，我们用过氧化氢作为凋亡诱导剂。在我们的实验中，200 M 的 H2O2 可以完全导致 L02 细胞凋亡。临床使用的异丙酚以脂肪乳剂作为溶剂，但有文献报道脂肪乳剂也具有一定的抗氧化作用 18。因此为了排除溶剂的干扰，我们将异丙酚纯品溶解于 DMSO，并将 DMSO 的终浓度控制在 0.
23、3%以下。我们发现 50 M的异丙酚开始发挥抗凋亡作用，当浓度增至100，300M 时效应更加明显。这说明高浓度的异丙酚在体外对肝细胞有保护作用，这也提示异丙酚适用于临床的肝脏手术。尽管有不少研究证明 ERK 具有抗 I/R 损伤的作用，但是最近有报道在中性粒细胞中，异丙酚抑制了 FLMP 诱导的 ERK 的磷酸化活性 19。而我们的实验则证实异丙酚能显著刺激人肝细胞 ERK 的活性表达，并且 ERK 的激活完全依赖异丙酚的作用而不是 H2O2 引起的。据文献报道在心肌细胞中，低浓度的H2O2 就可以上调 ERK 的活性 20，而我们发现 200 M的 H2O2 并不能激活 L02人肝细胞中的
24、 ERK。我们认为这种差异可能是不同的细胞类型造成的。在进一步的实验，我们发现 ERK 的上调有一定的时间、浓度效应。用 PD98059 可以逆转异丙酚对肝细胞的保护作用，细胞的死亡数量明显回复。这说明 ERK 信号通路是异丙酚发挥作用的关键分子。Bcl-2 家族蛋白是与凋亡相关的重要分子，可以分为两部分的成员：抗凋亡基因如 Bcl-2、Bcl-x L,促凋亡基因如 Bax 和 Bad21。这两类基因的表达比例决定了细胞最终的命运是存活还是死亡。临床研究中，一些抗氧化药物，例如MnSOD 调节 Bax 和 Bcl-2 的比例 22。基于以前报道 ROS 和 MAPKs 可以调节Bcl-2、Bc
25、l-x L、Bad 和 Bax， 我们检测异丙酚是否调节这些基因的表达。Real-Time PCR 结果证实：异丙酚处理后，Bcl-2 和 Bcl-xL 的 mRNA 表达水平并没有明显的改变，但是 Bad 和 Bax 的 mRNA 水平明显降低。随之，抗凋亡和促凋亡基因的表达比例增加，进而减少了细胞色素 c 的释放。这些分子的表达水平变化进一步解释了为什么异丙酚能够促进 L02 细胞存活。此外，有些研究表明Bcl-2 是强有力的促存活因子，能够有效的对抗多种应激细胞凋亡 23。已知多种蛋白激酶，包括 MAPKs 能够磷酸化 Bcl-2，从而激活它的抗凋亡功能。最近的研究也发现异丙酚可以通过影
26、响 Bcl-2 和 Bax 的表达来减少 TNF-alpha 引起的细胞凋亡 24。但是 Muto 等报道过表达 Bcl-2 促进缺血再灌注损伤引起的肝细胞凋亡 25。然而，在我们的研究中，Bcl-2 的表达没有明显改变。这样的差异可能是由于细胞类型及实验条件不同引起的。我们的研究首次提供了证据：在氧化剂引起的凋亡中异丙酚对肝细胞具有保护作用。考虑到所有的这些数据都只是来自体外实验，我们的结果和一些动物实验以及临床实验的结果不一致。在有限的报道中，异丙酚在缺血再灌注引起的肝损伤中的作用有些矛盾。Navapurkar 等报道了在氧化应激的大鼠肝细胞中异丙酚具有抗凋亡作用，但最近 Shimono
27、等的研究却显示异丙酚对低氧引起的大鼠肝损伤没有任何显著作用 26, 27。导致这些不一致的原因可能如下：1，为了有效的检测异丙酚作用机制，我们实验采用的浓度范围比较广，超出了临床使用剂量；2，L02 细胞是体外培养的来自单一克隆的肝细胞，排除了他类型细胞的干扰，如 Kupper 细胞、中性粒细胞等会产生 ROS、对抗氧化效应；3，考虑到异丙酚的药理结构是高度脂溶性具有酚基团 28，易在脂质环境药效。而体外实验不能完全模拟体内环境，前者需要更高的浓度才能起效。虽然我们的研究表明 ERK 磷酸化可以被异丙酚激活并且对于它的抗凋亡作用是必需的，我们并不能排除其他一些激酶也参与这个过程的可能，如 PI
28、-3K、PKB 等 29, 30。基于我们目前的研究，有必要进一步检测在其他缺血再灌注模型中，如低渗应激、缺养/复氧或者机械过载等，是否异丙酚也能激活 MEK-ERK 通路。此外，Acquviva 等发现异丙酚可以通过改变 HO-1 的表达，是否参与其抗凋亡作用尚不清楚 31。并且，对于 ERK 是否涉及异丙酚处理后的 Bcl-2家族蛋白磷酸化也未知。所以有必要继续深入进行探索研究。纵观本文，我们的结果揭示在 H2O2 引起的应激，异丙酚对肝细胞的保护作用可能部分的通过激活 ERK 通路以及下调 Bax 和 Bad 的表达起作用。因而，我们的研究提供了新的证据：异丙酚对肝细胞没有潜在的损害性，
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49、all nuclei were stained by DAPI (blue). Bar: 200 m. (B) Percentage of apoptotic cells at various concentrations of propofol was determined by the ratio of apoptotic nuclei to total nuclei number (10 fields per experiment, n=3). * # P0.05 versus DMSO (0 M propofol) treated cells. (C) Caspase-3 cleavage was determined by western blot analysis. (D) The quantified data was analyzed from separate experiments (mean SEM, n=3), and value of propofol preconditioned cells was set as 1. * # P0.05
