1、钩距虾脊兰 ISSR-PCR 反应体系的建立与优化安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2009,37(31):1516015162 责任编辑李菲菲责任校对傅真治钩距虾脊兰 ISSR-PCR 反应体系的建立与优化彭德镇,孙小琴,孔令杰,李恩香,杨柏云(南昌大学生命科学学院江西南昌 330031)摘要目的 为钩距虾脊兰种质资源研究奠定基础.方法以钩距虾脊兰为试验材料,剞硝改良的 CTAB 法提取钩距虾脊兰基因组DNA,并对影响 ISSR 扩增反应的各因素进行优化 .结果获得了高质量的钩距虾脊兰基因组 DNA;同时,建立了最适的钩距虾脊兰ISSR-PCR 体系,即 25PCR
2、 反应体积中,2.510PCRbuffer,2.0mmol/LMgCl,100ng模板 DNA,240i.Lmol/LdNTPs,1.75UTaqDNA 聚合酶,0.4Imol/L 引物;最佳扩增程序为 94 预变性 5min,然后进行 4J0 个循环:94变性 30s,复性温度根据各引物的 TM 值略低 l2,30s,72延伸 5Os,循环结束后 72延伸 7min,4保存.结论这一优化系统的建立为进一步利用 ISSR 分子标记技术进行钩距虾脊兰遗传多样性研究提供了基础.关键词钩距虾脊兰;DNA 提取:ISSR 分子标记中图分类号$682.31 文献标识码 A 文章编号 0517661l(2
3、0O9)3l 一 1516003EstablishmentandOptimizationofISSR-PCRReactionSystemfor(?alanthegraciliflaraHayataPENGDe-zhenetal(CollegeofLifeSciences,NanchangUniversity.Nanchang.Jiangxi330031)Abstract【ObjectiveTheresearchaimedto1.dvthefoundationforthegermplasmresourcesresearchesofCalanthegracilifloraHayata.Method
4、Withcgracilifloraasthetestmaterials,thegenomieDNAwasextractedfromC.graciliflorabyusingimprovedCTABmethod.Dif-ferentfactorsthataffectedISSRamplificationreactionwereoptimized.ResultHighqualitygenomieDNAwasobtainedfromC.gracilifloraHayata.AndthereactionsystemandamplifiedprocedurethatweresuitableforC.gr
5、acilifloraHayatawereasfollows:25txlamplificationreactionssystemcontained2.510PcRbuffer,2.0mmol/LMgcl2,100nggenomicDNA,240mol/LdNTPs,1.75UTaqDNApolymeraseand0.4p.mol/LISSRprimer.Theoptimalamplifiedprocedurewasasfollows:pre.denaturingfor5minat94.40cyclesofdenaturingfor30sat94,annealingfor30sdueto1 2lo
6、werthandenaturingtemperatureofdifferentprimer.extendingfor50sat72.finallyextendingfor7minat72oCandpreseringat4oC.Conclusion】,I11eoptimalsystemcouldprovideabasisforfurtherstudyongeneticdiversitvofC.gracilifloraHayatabyISSRmolecularmarker.KeywordsCalanthegracilifloraHayata:DNAextraction:ISSR钩距虾脊兰(Cala
7、nthegracilifloraHayata)属于兰科(0r-chidaceae)虾脊兰属(Calanthe), 是多年生草本陆生兰,江西省内均有分布.兰科植物多为珍稀濒危植物,全世界所有野生兰科植物均被列入野生动植物濒危物种国际贸易公约的保护范围,占该公约应保护植物的 90%以上 j.近年来,由于钩距虾脊兰慢慢地被人们所发掘和利用,其自然生境和野生资源遭到了严重的破坏.我国目前关于兰科植物的研究主要集中在形态学,分类学,生理学,孢粉学,区系地理学,繁殖生物学和菌根共生等方面 j,而关于居群遗传学的研究则很少.近年来,应用 ISSR 技术对植物进行遗传多样性的研究已有较多报道,而采用 ISSR
8、 技术对野生钩距虾脊兰的遗传多样性和居群遗传结构进行的研究目前尚未有报道.1 材料与方法1.1 材料钩距虾脊兰(CalanthegracilifloraHayata)试验样品采自江西省赣州市安远县的自然居群,采集 l8 个凭证标本供研究用.提取 DNA 使用比较幼嫩的叶片,样品用硅胶干燥法进行干燥.1.2 方法1.2.1DNA 的提取及检测.采用改良的 CTAB 法提取基因组 DNA,具体步骤为:取 0.05g 硅胶干燥的叶片,置于 1.50fTll 离心管中,加入 0.01gPVP 粉,加液氮研磨成粉末,加入65预热的 O.75ml2CTAB 缓冲液(pH 值 8.0),20.0oB.硫基乙
9、醇 ,65水浴 50min,水浴过程每隔 10min 轻轻摇动;冷却至室温,加 0.75rnl 氯仿:异戊醇(24:1),混合均基金项目作者简介收稿日期国家环保总局项目(20061A0013).彭德镇(1986 一), 男,江西九江人,硕士研究生,研究方向植物分子生物学.通讯作者 .2009-06-23匀,12000r/min 离心 10min;吸取上清液,加等体积的氯仿:异戊醇(24:1)再离心抽提 1 次;取上清液,加入 0.50 倍体积的 5.00mol/LNaC1,混匀,加入等体积一 20cc 预冷的异丙醇,轻轻摇匀,放置 2.0h 或过夜;12000r/min 离心 10min,使
10、DNA 附着在离心管管底,弃水相;加 70%乙醇洗涤 2 次,用无水乙醇洗涤 1 次,风干;用适量的 0.1TE 溶解 DNA,一 2O长期保存备用.通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计对 DNA 进行检测.用 1.0%琼脂糖电泳检测DNA 质量;用分光光度计测定其纯度和浓度DNA 纯度用OD260/0D280 的比值来检测;DNA 浓度(m1)=0,J 50稀释倍数,计算 DNA 获得率(DNA 量/所用叶片量100%).1.2.2ISSRPCR 条件筛选.引物参照哥伦比亚大学提供的序列(UBC810 一 UBC9OO),由上海生物工程技术服务有限公司合成,引物使用浓度为 5.00Ixmol/
11、L.TaqDNA 聚合酶,dNTPs 及相应缓冲液购自上海博彩生物有限公司.反应体系为 25.001,其中 10buffer2.50txl,引物浓度为 0.40txmol/L,为确定 PCR 反应中其他因素 (DNA 模板,DNA聚合酶,M 和 dNTPs)的最佳水平,DNA 的浓度分别为 75,100,200,4O0,800ng,酶浓度为 1.00,1.25,1.50,1.75,2.00U,Mg“的浓度分别为 1.5,2.0,2.5,3.0mmol/L,dNTPs的浓度为 120,160,200,240,280mol/L.1.2.3ISSR 引物筛选.ISSR 引物根据加拿大 British
12、Columbia 大学公布的序列设计,由上海生物工程技术服务有限公司合成,编号为 UBC810UBC900, 共 96 条引物 .1.2.4 电泳和拍照.用含有 0.1%EB 的 1.5%琼脂糖凝胶对 PCR 扩增产物进行电泳.在 100V 稳压和 100nlA 电流下电泳约 50min,电泳后的凝胶在凝胶成像仪下拍照并保存.37 卷 31 期彭德镇等钩距虾脊兰 ISSR-PCR 反应体系的建立与优化 l5l612 结果与分析2.1DNA 模板浓度对 ISSR.PCR 反应的影响从图 1 可以看出.模板浓度在 75200ng 均能得到清晰,稳定的条带,基本没有非特异性扩增,产物稳定;模板浓度高
13、达 4O0ng 以后,虽也能扩增出条带,但随着浓度的升高,条带弥散现象明显;模板浓度达到 800ng 就完全不能扩增出条带.从图 1 中还可以发现,模板浓度在 100ng 时扩增出的条带最清晰.注:15.模板浓度 800rig;610.模板浓度 400ng;11l5. 模板浓度 200ng;1620.模板浓度 100ng;2125.模板浓度 75ng.Note:15.templateconcentrationof800ng;610.templatecon.centrationof400ng;1115.templateconcentrationof200rig;l620.templateconc
14、entrationof100ng;2125.templateconcentrationof75ng.图 1DNA 浓度对 ISSR 扩增的影响Fig.1EffectsofDNAconcentrationoilISSRamplification2.2TaqDNA 聚合酶浓度对 ISSR.PCR 反应的影响在不同 T(u/DNA 聚合酶浓度梯度下 ,PCR 扩增结果见图 2.从图 2 可以看出,随 TaqDNA 聚合酶浓度升高呈梯度变化,但不同浓度下产物的差异较大当 raqDNA 聚合酶浓度为1.001.75U 时,有较亮条带出现;浓度达到 2.0ou 时,条带数目较少且不清晰.当 DNA 聚合酶
15、浓度为 1.75U时,PCR 扩增产物能得到清晰稳定的条带,且无非特异性扩增,背景较晴.因此,DNA 聚合酶浓度在该组试验中的最适浓度为 1.75u注:15.TaqDNA 聚合酶浓度 1.00U;610.7DNA 聚合酶浓度1.25U;1115.TaqDNA 聚合酶浓度 1.5oU;162n7DNA 聚合酶浓度 1.75U;2125.DNA 聚合酶浓度 2.(30U.Note:15.TaqDNApolymeraseconcentrationof1.00U:610.TaqDNApolymeraseconcentrationof1.25U;1l 一 15.DNApolymeraseconcentr
16、ationof1.50U;1620.TaqDNApolymeraSeconcentrationof1.75U:2125.TaqDNApolymeraseconcentrationof2.00U.圈 2TaqDNA 聚合酶对 ISSR 扩增的影响Fig.2EffectsofTaqDNApolymeraseoHISSRamplification2.3Mg 浓度对 ISSR.PCR 反应的影响从图 3 和图 4 可以看出,电泳结果随 Mg 浓度升高而呈梯度变化,4 个浓度梯度都检测到电泳条带.M 浓度为 1.5mmol/L 时有条带出现,但数目较少;当浓度过高,达 2.5mmoVL 以上时,背景较亮
17、,且条带模糊不清,非特异性扩增较多.整体比较可以得出,Mg2 浓度在 2.0mmol/L 时,PCR 能得到清晰稳定的条带,且无非特异性扩增,背景较暗,为最适合浓度.因此,Mg2 浓度在该试验中采用 2.0mmol/L.注:112.Mg:浓度为 1.5mmol/L;1324.M 浓度为 2.0mind/L.Note:112.Mg“concentrationof1.5mmol/L;1324.Mg“concentrationof2.0mmo1/L.图 3Mg 浓度对 ISSR 扩增的影响Fig.3EffectofMeconcentrationonIssRamplification注:l12.Mg“
18、浓度为 2.5mmol/L;1324Mg2 浓度为 3.0mmol/l.Note:112.Mg-concentrationof2.5mmd/L;1324Mg“concentrationof3.0mmoL/L.图 4M 浓度对 ISSR 扩增的影响Fig.4EffectoftagconcentrationonISSRamplification2.4dNTPs 的浓度对 ISSR-PCR 反应的影响从图 5 可以看出,试验所采用的 dNTPs 浓度对扩增的影响并不明显.160280Ixmol/L 时得到的产物基本一致,但过高或过低的浓度都使得 PCR 产物较为模糊.因此,选用中间的浓度 240i.
19、rmol/L 进行后续的研究,该浓度的条带清晰,背景较暗.注:15.dNTPs 浓度为 120moUL;610.dNTPs 浓度为 160imol/L;1115.dNTPs 浓度为 200p.mol/L;1620.dNTPs 浓度为 240p.mol/L;2125.dNTPs 浓度为 280moULNote:15.dYFPsconcentrationofI20tmol/L:610.dNTPscon.centrationof160p,mol/L;l115.dNTPsconcentrationof200pmo/L;16 一加.dNTPsconcentrationof240I.tmol/L;2125
20、.dNTPsconcentrationof280moVL.图 5dNTPs 浓度对 ISSR 扩增的影响Fig.5EffectsofdNTPsconcentrationonISSRampiification2.5 引物筛选的结果(表 1)筛选 DNA 模板浓度时,同时各浓度梯度依次筛选 810,821,822,825,8285 个引物,如图 115162 安徽农业科学 2009 笠筛选出 810,822,825,828.筛选 TaxlDNA 聚合酶浓度时,同时各浓度梯度依次筛选 843,856,885,886,8885 个引物,如图 2 筛选出 843,856,886.筛选 Mg“浓度时,同时
21、各浓度梯度依次筛选 834,836,840,846,843,849,852,853,855,856,858,860 这 12 个引物,如图 3 和图 4 筛选出 84O,843,855,856.筛选 dNTPs 浓度时,同时各浓度梯度依次筛选 811,815,855,887,889 这 5 个引物,如图 5 筛选出 811,815,855,887,889.表 1ISSR-PCR 反应体系各成分优化试验设计Table1OpammdesignofcoinponentsforISSR-PCRn 嘲 cd0nsystem序号序列序号序列No.SequencesNo.Sequences810GAGAGA
22、GAGAGAGAGAT843CTCTCTCTCTCTCTCTRA8l1GAGAGAGAGAGAGAGAC855ACACACACACACACACYT815CTCTCTC1,CTCrI1cTG856ACACACACACACACACYA822TcTCTCTCTCTCTCTCA886VDVC.rC1TCTCTCTCT825ACACACACACACACACT887DVDTCTC1,CTCTCT【=TC828T(GTG 亿 TGTGT(GA889DBDACACACACACACAC40GAGAGAGAGAGAGAGAYT注:N=(A,C,T,G);R=(A,G);Y=(C,T);B=(C,G,T);D=(A
23、,GT);H=(A,C,T);V=(A,C,G).Note:N=(A,C,T,G);R:(A,G);Y=(C,T);B=(C,G,T);D=(AG,T);H=(A,C,T);V=(A,C,G).3 结论与讨论(1)该研究通过对各影响因子的筛选,确定钩距虾脊兰ISSR 的扩增条件,即 2.510PCRbuffer,2.0mmol/LMgC1,100ng 模板 DNA,240mol/LdNTPs,1.75UgDNA聚合酶,0.40txmolfL 弓 l 物;最佳扩增程序为:94预变性 5min,然后进行 40 个循环,94变性 30s,复性温度根据各引物的 TM 值略低 12,30s,72延伸 5
24、0s,循环结束后72cc 延伸 7min,4保存.(2)Mg2 浓度是 ISSR.PCR 的一个主要变化因素,作为TaqDNA 聚合酶的辅助因子 ,Mg2 浓度不仅影响 TaqDNA聚合酶的活性,还能与反应液中的 dNTPs,模板 DNA 及引物结合,影响引物与模板的结合效率,模板与 PCR 产物的解链温度,产物的特异性和引物二聚体的形成.引物与模板的双链杂交体的解链与退火温度受二价阳离子的影响,Mg2浓度影响反应的特异性和扩增片段的产率“.该研究对所采用的每 12 个引物设置了 Mgz 浓度梯度比较,即 1.5,2.0,2.5,3.0mmol/L.该研究表明,PCR 反应中,1.53.0mm
25、ol/L 是较合适的 Mg2 浓度范围.考虑到太低 Mg2 浓度会影响 DNA 聚合酶的活性,不利于 PCR 扩增,而高浓度会导致非特异性扩增的出现,使得背景模糊难以统计分析,该试验最终确定了合适的 Mg“优化浓度为 2.0mmol/L.(3)在 ISSR.PCR 反应体系中,TaqDNA 聚合酶直接影响扩增反应的成功与否.不同厂家甚至同一厂家不同批次的产品都会得出不同的 PCR 扩增结果“,因此选取合适厂家的 Z 酶很重要.在试验过程中,要尽量选用同一厂家同一批次的 TaqDNA 聚合酶.此外 ,ToxlDNA 聚合酶用量对 PCR 扩增也有很大影响.浓度太低,聚合酶的催化能力不够强,合成效
26、率不高;浓度太高,会得到非特异性扩增条带,同时扩增条带的背景模糊,不易辨认.试验表明,DNA 聚合酶浓度在 1.002.0ou 时能得到清晰的条带,但为减少非特异性扩增条带的出现,后续的试验采用 1.75U的 ToxlDNA 聚合酶浓度.(4)在 PCR 反应中 ,作为模板的 DNA 所需浓度很低.在每个反应体系(25.o01) 中,DNA 所需浓度一般在 38ng/l,其适宜浓度范围较大.一般来说,模板过少,分子碰撞的机率低,偶然性大,影响扩增产物的稳定性;模板过多又会降低特异性扩增效率,增加非特异性产物.该研究将钩距虾脊兰ISSRPCR 扩增的模板用量选定为每个反应 4ng/.(5)dNT
27、Ps 是 PCR 反应的原料,常用浓度的 4 种 dNTPs各 100300mol/L. 过高或过低的 dNTPs 浓度都使得 PCR产物模糊不清,究其原因可能是浓度太高容易产生错配,同时与 TaqDNA 聚合酶竞争 M,使 TaqDNA 聚合酶不能充分发挥聚合活性,导致扩增失败;浓度太低则扩增产率低 ,甚至会因为 dNTPs 的过早消耗完而使产物单链化.所以筛选比较适合的 dNTPs 浓度至关重要.该研究对所采用的每12 个引物设置了 dNTPs 浓度梯度比较,即 120,160,200,240,280txmol/L,筛选结果表明,240p,mol/L 的 dNTPs 浓度是最适合的.参考文
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