1、社区获得性肺炎非典型致病原 流行病学调查 解放军总医院 王 睿,对于社区获得性肺炎的致病原的研究是一个全世界比较关注的问题。近年来，随着对非典型致病原（肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌）分离鉴定水平的提高，其在下呼吸道感染中的地位逐渐被人们所认识。我国关于非典型致病原所致社区获得性肺炎的研究很少，为了解非典型致病原感染现状，我们参加了亚洲地区多中心社区获得性肺炎流行病学调查。,资料和方法 病例入选标准 住院或门诊病人，年龄大于18岁；X线胸片有新的浸润或实变，并且不能用其他原因解释；病人同时必须有下列症状或体征至少3项： （1）咳嗽、咳嗽加重或无痰干咳； （2）痰性质的突然改变； （3）体温
2、38或36.1或在近24小时内有明确的发热 或体温过低； （4）肺部听诊有罗音或其他肺实变证据； （5）白细胞增加； （6）全身不适、肌肉痛或胃肠道症状,病例排除标准 有结核病史或结核证据； 医院获得性肺炎； 肺癌； 吸入性肺炎； 支气管扩张； 就诊前2周内曾住院的患者； HIV阳性患者； 使用免疫抑制剂患者。,临床资料 病例收集： 收集2001年11月至2002年3月解放军总医院、北京大学第三医院、北京友谊医院、海军总医院社区获得性肺炎患者共52例。 年龄1886岁，平均年龄43.7521.5岁 男性29例，女性23例。 标本采集： 取患者急性期及恢复期静脉血标本、 急性期尿标本、 痰标本（
3、无痰者留取咽拭子），共有痰标本49个，咽拭子标本3个。,标本采集方法与处理 1 血清学标本： 抽取静脉血按常规方法分离血清，间隔2-4周再采血一次，与第一次标本同时进行血清学检测。 2 PCR标本： 取患者痰标本200l加入含1ml 10:1 TE缓冲液（pH8.0）的小离心管中；咽拭子标本用1.0ml上述缓冲液浸泡棉签，经反复挤压后弃掉棉签。二者皆震荡30秒后，-20保存至DNA提取。 3 尿液标本： 尿液用无菌容器留取，取1.5ml -20保存。,PCR方法 应用PCR方法扩增病原体特异基因，之后行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯观察电泳条带，确定PCR产物大小。 引物： 肺炎支原体：选用针对P1粘
4、附蛋白基因的一对引物，序列为： 正向引物：5-GCCACCCTCGGGGGCAGTCAG-3； 反向引物：5-GAGTCGGGATTCCCCGCGGAGG-3。 肺炎衣原体：选用扩增目标是16SrRNA的一对引物，序列为： 正向引物：5-TGACAACTGTAGAAATACAGC-3； 反向引物：5-CGCCTCTCTCCTATAAAT-3,DNA模板的制备以及PCR扩增 取200l上述标本储存液，13，000rpm离心30分钟，收集标本，去上清后加50l裂解液55水浴1小时，煮沸15分钟，放于4，作为DNA模板备用。若PCR扩增中有抑制剂存在，则用酚-氯仿抽提DNA。 PCR扩增加用UNG预
5、处理，消除既往DNA扩增所致污染；若应用内参照检测标本中有抑制剂存在，则应用标准的酚-氯仿方法抽提DNA，再次扩增。,琼脂糖电泳 制备1.5%的琼脂糖，加8lPCR扩增产物，在5V/cm电压下电泳45分钟后观察结果。P1基因扩增阳性片段大小为209bp，16SrRNA基因扩增阳性片段大小为463bp。 3、尿抗原检测 应用德国Biotest公司生产的酶联免疫检测（EIA）方法检测尿中嗜肺军团菌可溶性血清型抗原。阳性标准：OD值cut-off值，尿中存在军团菌抗原，考虑现在或过去有军团菌感染。,结 果 52例患者中有24例诊断为肺炎支原体感染，阳性率为46.2%，其中支原体血清抗体和PCR检测皆
6、阳性20例，确诊阳性率为38.5%；3例患者PCR阳性而血清抗体阴性，1例患者血清抗体阳性而PCR阴性，可疑阳性率为7.7%， 2例患者诊断为嗜肺军团菌感染，阳性率为3.8%。3例患者诊断为肺炎衣原体感染，阳性率为5.8%。 3例患者存在合并感染，2例为肺炎支原体合并肺炎衣原体感染，1例为肺炎支原体合并嗜肺军团菌感染。,24例肺炎支原体感染患者中，男性12人，女性12人，二者无显著性差异。24例患者中4人合并有心肺疾病或糖尿病，但与非肺炎支原体感染患者相比，无显著性差异。 从年龄上看，18-30岁占13人，31-40岁占8人，41-50岁0人，51-60岁0人，61-70岁3人，以18至40岁
7、为多见。 从发病月份上看，11月有15人，12月有2人，1月有5人，2月、3月分别有1人，92%的患者集中在11月至次年1月。,表1 52例患者感染分布情况表,感染源 感染病例数 感染百分率 可疑为单纯支原体 21 40.4 确诊为单纯支原体 17 32.7 单纯衣原体 1 1.9 单纯军团菌 1 1.9 支原体+衣原体 2 3.8 支原体+军团菌 1 1.9,图1 52例患者感染情况图,表2：15例 肺炎支原体PCR（+）,双份血清抗体滴度呈 4倍或4倍以上升高或减低的检测值,编号 急性期血清抗体 恢复期血清抗体1 1:40 1:801:640 1:1638401:40 1:801:80 1
8、:6401:20480 1:5120 6 1:40 1:801:5120 1:81920 8 1:320 1:2560,表2：15例 肺炎支原体PCR（+）,双份血清抗体滴度呈 4倍或4倍以上升高或减低的检测值,编号 急性期血清抗体 恢复期血清抗体9 1:40 1:64010 1:327860 1:40960 11 1:40 1:1024012 1:1280 1:1024013 1:640 1:2048014 1:40 1:256015 1:40 1:80说明：15例患者占诊断为肺炎支原体感染的62.5%，占调查总人数的19%,表3. 5例肺炎支原体PCR（+），双份血清抗体滴度持续大于或等于
9、1：160的检测值,编号 急性期血清抗体 恢复期血清抗体16 1：320 1：32017 1：2560 1：256018 1：640 1：64019 1：640 1：64020 1：2560 1：1280说明：5例患者占诊断为肺炎支原体感染的20.8%，占调查总人数的9.6%,表4. 4例肺炎支原体PCR与血清抗体检测不符合情况,编号 PCR 急性期血清抗体 恢复期血清抗体21 1： 20480 1：2048022 + 1:40 1:4023 + 1:40 1:8024 + 1:40 1:40,表5 7例患者混合细菌感染情况,患者编号 混合感染的致病原1 肺炎链球菌+肺炎支原体+嗜肺军团菌2
10、流感嗜血杆菌+肺炎支原体3 肺炎链球菌+肺炎支原体+肺炎衣原体4 流感嗜血杆菌+肺炎支原体5 肺炎支原体+肺炎衣原体6 肺炎链球菌+流感嗜血杆菌+肺炎支原体7 肺炎链球菌+肺炎支原体,图2 24例支原体CAP感染患者年龄分布图,图3 24例支原体CAP感染患者发病月份分布图,讨 论 近年来非典型致病原在社区获得性肺炎中的作用逐渐受到重视。国外报道在社区获得性肺炎中，由非典型致病原所致者大约占340%。大多数研究显示肺炎支原体感染在非典型致病原所致的社区获得性肺炎中发病率为首位，在成人CAP患者中占2-30%左右；军团菌属作为社区获得性肺炎散发感染的病原体，在从欧洲到北美洲的各国研究显示其发病率
11、为2-15%；而肺炎衣原体，约占社区获得性肺炎的6-22%。,本实验52例患者中共有26例诊断为非典型致病原感染，占调查总人数的50%，其中肺炎支原体感染为24例，占非典型致病原的92%。在24例判断为肺炎支原体感染患者中，20例PCR、血清学检测皆为阳性，4例可疑为肺炎支原体感染。 2例军团菌感染患者，皆存在双份血清抗体滴度动态升高，故诊断为现症感染。,本次调查收录的为11月至次年3月份的患者，集中在秋冬季节，故致病原的分布受其影响，导致不典型致病原所占比例较高。本研究显示肺炎支原体感染尤以11月至次年1月发病率为高，且以40岁以下多见，与国外报道相符。 综上所述，非典型致病原尤其是肺炎支原体感染在社区获得性肺炎中占据重要地位，需引起临床医生重视。,THANK YOU,
