1、1水 稻 二 化 螟 抗 药 性 检 测 技 术 规 范 -饲 料 混 毒 法1 范 围本 标 准 规 定 了 饲 料 混 毒 法 检 测 二 化 螟 （ Chilo suppressalis (Walker)） 抗 药 性 的 方 法 。 本标准适用于杀虫剂对二化螟室内毒力测定和抗药性评估。2 术 语 和 定 义2.1 抗药性 R esistence 昆虫忍耐杀死正常种群大部分个体的药量的能力，并在其种群中发展起来的能力。2.2敏 感 基 线 Susceptibility baseline 在某种农药使用之前，该种药剂对昆虫敏感品系的毒力基线及 LD50 或 LC50。2.3 饲 料 混 毒
2、 法 Artificial diet incorporation bioassay method 二化螟幼虫接触、取食混药的人工饲料而中毒死亡的毒力测定方法。3 试 剂 与 材 料3.1 生物试材：二化螟： 4 龄初期幼虫。3.2 试验试剂与药剂：试剂为分析纯，药剂为原药。4 主 要 仪 器 设 备电 子 天 平 （ 感 量 0.0001g） ， 手持搅拌机， 料理机， 毛笔， 眼科镊， 移液器， 平底玻璃管 （直径 3cm， 高 5cm） ， 1000ml 烧 杯 （ 直 径 13cm， 高 15cm） ，恒温 培养箱、恒温养虫室或人工气候箱，高温高压湿热 灭菌锅，微波炉。5 试 验 步 骤
3、5.1 卵块采集、管理及混毒饲料配制15.1.1 卵块采集：2在成虫盛发期，可从田间诱蛾带回室内产卵或从水稻田直接采集二化螟卵块。5.1.2 卵块孵化及幼虫管理在 玻 璃 培 养 皿 （ 直 径 9cm） 中 放 入 滤 纸 3-4 片 ， 并 加 入 适 量 灭 菌 蒸 馏 水 保 湿 ， 将 卵 块 放 入 其 中 ， 保 湿培养至卵块黑头时， 将黑头卵块放入装有饲料的玻璃管中， 每个玻璃管中放入 1-2 个卵块， 塞上棉花 塞。 待幼虫从卵块中孵出并爬至饲料上后， 将卵块残余部分从玻璃管中挑出来， 然后将幼虫放置于温度 281 ， 相 对 湿 度 60%-70%， 光 照 比 （ L：
4、D） 16： 8hrs（ 下 光 照 ） 的 光 照 培 养 箱 中 培 养 至 4 龄 。5.1.3 药 剂 配 制用电子天平或移液器称量若干原药， 加入水或有机溶剂 （如丙酮、 二甲基甲酰胺等） 溶解配制成药 剂母液，然后按所需浓度的量用移液器加入到已装有 30ml 含 10 （ m/v） Triton-X 100（ 或 吐 温 80） 灭菌蒸馏水的烧杯（直径 13cm， 高 15cm） 中 ， 充 分 混 匀 后 备 用 。5.1.4 人工饲料配制方法按中国农科院植保所（2009）的人工 饲料配方进行配制（见附录 B） 。具 体如下：（1） 将各组分按配比称重，备用；（2） 将 新 鲜
5、的 茭 白 切 碎 ， 加 入 水 ， 放 入 料 理 机 中 磨 碎 并 匀 浆 ， 匀 浆 后 将 其 倒 入 盛 有 大 豆 粉 、 酵 母 粉 、 干酪素和蔗糖的灭菌桶中，将上述 5 种 组 分 充 分 搅 拌 均 匀 后 ， 置 于 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 中 ， 于 125下灭菌 30min， 灭 菌 完 毕 后 ， 取 出 备 用 ；（3） 琼脂中加入纯净水， 用微波炉加热并煮至完全溶解后， 将其倒入步骤 （2） 中已灭菌好的饲料中， 用手持搅拌机搅拌混匀，并冷却至 60 左 右 备 用 ；（4） 将称好的抗坏血酸钠、尼泊金酯、山梨酸、胆固醇、氯化胆碱、威氏盐、复合维生素放入
6、烧杯 中 ， 用 少 量 温 开 水 溶 解 ， 然 后 将 其 倒 入 步 骤 （ 3） 中 的 饲 料 中 ， 再 加 入 40%的 甲 醛 ， 搅 拌 直 至 完 全均匀；（5） 将搅拌好的饲料倒入无菌的保鲜盒中，完全冷却凝固后存放于 4 冰 箱 中 备 用 。5.1.5 混毒人工饲料的配制方法按上述方法制备人工饲料， 在加入 40%的甲醛并 搅拌均匀后， 在 预 先 盛 有 30ml 药 液 （含 10 （ m/v） 的 Triton-X 100（或吐温 80） ） 的烧杯 中快速加入 270 克人工饲 料， 并用手持搅拌机充分搅拌混匀制得 混 毒 饲 料 ， 然 后 快 速 地 用
7、10ml 移 液 器 将 混 毒 饲 料 分 装 至 平 底 玻 璃 管 （ 直 径 3cm， 高 5cm） 中 ， 饲 料 含 量 为 8ml/管 ， 然 后 塞 上 棉 花 塞 ， 贴 好 标 签 ， 用 橡 皮 筯 按 5 管 /组 扎 好 ， 待 其 完 全 冷 却 凝 固 后 存 放 于 4冰 箱 中 备 用 。 空 白 对 照 处 理 的 饲 料 中 ， 以 不 含 药 剂 的 30ml 灭 菌 蒸 馏 水 （ 含 10 （ m/v） 的 Triton-X 100（或吐温 80） ）代替药液，其余处理同混毒饲料。5.2 处理方法将 混 毒 饲 料 （ 或 无 毒 饲 料 ） 挑 入
8、 平 底 玻 璃 管 中 。 然 后 将 4 龄 初 期 幼 虫 挑 入 ， 虫 量 为 10 头 /管 ， 并 把 相 同 浓 度 处 理 的 玻 璃 管 用 橡 皮 筯 扎 好 。 将 其 置 于 温 度 281 ， 相 对 湿 度 60%-70%， 光 照 比 （ L： D） 16：38hrs（ 下 光 照 ） 的 培 养 箱 中 。 每 个 浓 度 处 理 4 次重复。5.3 结果检查根 据 杀 虫 剂 的 杀 虫 特 性 分 别 于 接 虫 后 的 48-144 小 时 检 查 。 菊 酯 类 、 有 机 磷 类 、 大 环 内 酯 类 药 剂 在药 后 48 小 时 检 查 ； 苯
9、 基 吡 唑 类 、 酰 胺 类 和 沙 蚕 毒 素 类 在 药 后 96 小 时 检 查 ； 昆 虫 生 长 调 节 剂 类 药 剂 在 药后 144 小 时 检 查 。 死 亡 标 准 为 ： 以 小 毛 笔 或 尖 锐 镊 子 轻 触 虫 体 ， 不 能 正 常 爬 行 者 视 作 为 死 亡 个 体 。6 数 据 统 计 与 分 析6.1 计算方法根据调查数据，计算各处理的校正死亡率。按公式（1）和（2）计算，计算结果均保留到小数点后 两位：式中：P1 死亡 率，单位为百分率（%） ；K 表 示 死 亡 虫 数 ， 单 位 为 头 ；N 表 示 处 理 总 虫 数 ， 单 位 为 头
10、。KP1 =N 100% （ 1）P2 = Pt P01 P0100 % （2）式中：P2 校正 死亡率，单位为百分率（%） ；Pt 处理 死亡率，单位为百分率（%） ；P0 空白 对照死亡率，单位为百分率（%） 。 若 对 照 死 亡 率 20 ， 试 验 需 重 做 。6.2 统计分析采用SAS、EPA、POLO、BA、DPS等统计 分析系统软件的机率值分析法进行 统计分析，求出每个药剂 的 毒 力 回 归 方 程 式 、 LC50值 及 其 95 置 信 限 、 b值 及 其 标 准 误 。7 抗 性 水 平 评 估7.1 二化螟敏感毒力基线的制定二化螟抗性监测的敏感毒力基线见附录A。7
11、.2 抗性水平的分级标准抗性水平的分级标准见表1 。4表1 二 化 螟 抗 性 水 平 的 分 级 标 准抗性水平分级 抗性倍数敏感 RR5.0倍低水平抗性 5.0RR10.0中等水平抗性 10.0 RR 100.0高水平抗性 RR 100.07.3 抗性水平的计算与评估根 据 敏 感 品 系 的 LC50值 和 测 试 种 群 的 LC50值 ， 计 算 测 试 种 群 的 抗 性 倍 数 。 按 下 式 计 算 ， 计 算 结 果 均 保 留到小数点后一位：抗 性 倍 数 =测 试 种 群 的 LC50/敏 感 品 系 的 LC50。 按照抗性水平的分级标准，对测试种群的抗性水平作出评估。
12、8 监测报告编写根 据 统 计 结 果 和 抗 性 水 平 评 估 ， 写 出 正 式 抗 性 检 （ 监 ） 测 报 告 ， 并 列 出 原 始 数 据 。5附 录 A (资料性附录 )部分杀虫剂对水稻二化螟的敏感毒力基线表 A 1. 部 分 杀 虫 剂 对 二 化 螟 敏 感 品 系 的 毒 力 基 线LD-P 线药剂Y=LC50(95%置 信 限 )（ mg a.i./Kg)阿 维 菌 素 9.0687+2.4126X 0.0206(0.0169-0.0250)杀 虫 单 4.4854+2.7473X 1.54(1.32-1.79)氯 虫 苯 甲 酰 胺 6.0179+2.8121X 0
13、.4345(0.3746-0.5041)氟虫双酰胺 4.8056+1.4738X 1.355(1.036-1.772)甲氨基阿维菌素苯甲酸盐 12.8128+2.9423X 0.0022(0.0019-0.0026)三 唑 磷 5.303+2.9728X 0.7908(0.6764-0.9246)毒死蜱 5.1034+3.0929X 0.9259(0.787-1.089)注 ： 敏 感 品 系 为 2010年 引 自 中 国 农 科 院 植 保 所 ， 且 在 本 研 究 室 内 经 3代 次 单 卵 块 筛 选 ， 在 室 内 不 接 触 任 何 药 剂 的 情 况 下 以 人 工 饲 料
14、饲 养 30余 代 的 二 化 螟 品 系 。附录 B (资料性附录 )二化螟人工饲料的组份及其配比A、主要组分配比：大豆粉 4.37%； 酵母粉 2.91%； 干酪素 1.46； 蔗糖 1.46； 鲜 茭 白 1 4.56%； 琼 脂 1 .75%； 辅 料 0 .71%； 水 72.78%。B、每种辅料中各成份配比：抗坏血酸钠 （Vc） 0.437%； 山梨酸 0.146%； 胆固 醇 0 .029%； 氯化胆碱 0.044%； 威氏 盐 0.015%； 复合维生素B 0 .002%； 40%甲 醛 0.044%。 资料选自：中国农业科学院植物保护研究所，专利号：CN200910080336.2。
