1、过碘酸雪夫反应（PAS ）显示糖元和其它多糖物质 一、试剂配制 1.过碘酸酒精溶液配法 过碘酸（HIO42H2O） 0.4 克 95%酒精 35毫升 M/5 醋酸钠（27.2 克+1000 毫升H2O） 5 毫升 蒸馏水或用 0.5-0.1%过磺酸水溶液 10 毫升 上液保存于冰箱，瓶加黑纸，溶液显黄色即失效。 2.Schiff 氏酒精溶液配法（配后略带红色无妨） Schiff 氏原液 11.5毫升 1N 盐酸 0.5 毫升 纯酒精 23.0 毫升 或用 Schiff 氏原液，配法与 Feulgen 反应所用相同。 3.采取唾液的方法 刷牙、喇口之后，用 1%的醋酸在舌尖部稍稍接触，唾液开始分
2、泌之后，用烧杯盛接之，此唾液经过过滤后即可应用。 4.亚硫酸水（与 Feulgen 反应所用相同）。 5.Harris 苏木精。 二、操作方法 1.取 1-2 毫米厚的肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织块；一般用 Carroy 氏液固定较好；放冰箱 4-6 小时。用纯酒精饱和的苦味酸和甲醛混合液固定糖元较好；如只为显示粘蛋白等多糖类；可用萘克甲醛固定液；冰冻干燥法对于各种多糖的固定都是最好的。 2.经酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。 3.铺片。如染糖元，铺展时勿用水，改用 70%酒精。 4.经二甲苯脱蜡后进入纯酒精，再入含有 1%火棉胶的纯酒精 1 分钟，再入 70%酒精。 5.如染糖元，从 70
3、%酒精直接入过碘酸酒精溶液 5-15 分钟，经 70%酒精洗片刻，入 Schiff氏酒精溶液 15 分钟。染糖元的对照片须先用唾液配的 0.1-1%淀粉酶消化 30-60 分钟后再入染色液。 6.亚硫酸水洗三次。 7.流水冲洗 3-5 分钟。 8.蒸馏水洗。脱水经 95%、100% 酒精各二次。二甲苯透明、树胶封固。 或经蒸馏水洗后，入 Harris 苏木精复染 20-30 秒钟，将核染成浅蓝色，对彩色照相较好。如黑白照相则不必复染。 三、结果 糖元呈紫红颗粒，上皮粘蛋白呈淡到深紫红色。粘蛋白及中性粘多糖呈深紫红色。糖蛋白呈淡红色。肥大细胞颗粒呈现红色。经过唾液或淀粉酶消化者则无糖元的紫红颗粒
4、。 实验四 DNA 的 Feulgen 染色法 实验目的 学习 DNA 的 Feulgen 染色方法，观察染色结果，了解反应原理。 实验原理 DNA 经弱酸（1mol/L HCI ）水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与 Schiff 试剂( 无色品红亚硫酸溶液) 反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含有 DNA 的部位呈现紫红色阳性反应。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸或 DNA 酶处理，抽提去细胞中的 DNA 而得到阴性反应，从而证明了 Feulgen 反应的专一性。 实验
5、用品 一、材料 1.Carnoy 液固定的鼠肝石蜡切片。 2.Carnoy 液固定的洋葱根尖或蚕虫根尖切片。 二、试剂 1.Carnoy 固定液 3 份 95%酒精加入 1 分冰醋酸。 2. 1mol/L HCI。 取比重 1.18 的浓 HCI 82.5ml,加水至 100ml。 3.Schiff 试剂 先将 200ml 蒸馏水煮沸，由火上取下，加入碱性品红 1g,充分搅拌，有 助于溶解。待溶液冷到 50时，过滤到磨口棕色试剂瓶中。加入 1 mol/L HCI 20ml，冷却到25时加入 1g偏亚硫酸钾（K 2S2O2）或偏亚硫酸钠(NaS 2O5)充分振荡后盖紧瓶塞，放于暗处过夜。次日取出
6、，呈现淡黄色或近于无色，加中性活性炭一勺，约 0.5g，剧烈振荡 1min，过滤后即得无色品红。 无色品红配成后须塞紧瓶塞。外包黑布或黑纸，贮存在冰箱或黑暗低曙处。 4.亚硫酸水溶液( 漂白液) 10%偏重亚硫酸钠水溶液 5ml，蒸馏水 100ml，1 mol/L HCI5ml ，摇匀，塞紧瓶塞。此溶液在使用前配制，否则会因 SO2 的逸出而失效。 5. 5%三氯醋酸 6. 0.5%固绿酒精溶液(95% 酒精溶解) 。 实验方法 石蜡切片 溶蜡二甲苯 I （3-5min） 溶蜡二甲苯 (3-5min) 1/2 纯酒精+1/2 二甲苯 (3-5min) 纯酒精 （2-3min） 纯酒精 (2-3
7、min) 95%酒精 (2-3min) 83%酒精 (2-3min) 70%酒精 (2-3min) 对照组 蒸 馏 水 5%三氯醋酸，90，15min 实 验 70%酒精(2-3min) 组 1 mol/L HCI 蒸馏水（过一下） 1 mol/L HCI 60，8-15min（水浴或温箱中） Schiff 试剂 (60-90min) 亚硫酸水（ ） （各 5min） 流水冲洗 (5-15min) 蒸 馏 水 0.5%固绿水溶液（复染） (1min)(此步要快，以免过染) 蒸 馏 水 70%酒精 83%酒精 95%酒精 纯酒精 纯酒精 纯酒精 透明二甲苯 透明二甲苯 封 片 （贴上标签，注明材
8、料，反应名称，作者姓名及日期） 显微镜下检查： 实验组：细胞核呈紫红色。 核仁及细胞质呈绿色 对照组：由于 DNA 被提取破坏，所以细胞核无紫红色。 实验五 线粒体和液泡系的超活染色与观察 实验目的 一、观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布。 二、学习一些细胞器的超活染色技术。 实验原理 活体染色是指生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理。 根据所用染色的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外
9、活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。 活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为
10、适用，可能因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿 B（Janus green B ）和中性红（neutral red ）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。 实验用品 一、器材 显微镜、恒温水浴锅、触剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、载玻片、凹 面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。 二、试剂 1.Ringer 溶液 氯化钠 0.85g( 变温动物用 0.65g) 氯化钾 0.25g 氯化钙 0.03g 蒸馏水 100ml 2.10%、 1/3000 中性红溶液 称取 0.5g 中性红溶于 50ml Ringer
11、液，稍加热(30-40 ) 使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉泻，失去染色能力。 临用前，取已配制的 1%中性红溶液 1ml，加入 29ml Ringer 溶液混匀，装入棕色瓶备用。 3.1%、 1/5000 詹纳斯绿 B 溶液 称取 50mg 詹纳斯绿 B 溶于 5ml Ringer 溶液中，稍加微热(30-40 ), 使之溶解，用滤纸过滤后，即为 1%原液。取 1%原液 1ml 加入 49ml Ringer 溶液，即成 1/5000 工作液装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。 三、材料 1.小白鼠肝细胞。 2.人口腔上皮细胞。 3.洋葱鳞茎内表皮细
12、胞。 4.蟾蜍胸骨剑突软骨细胞。 5.小麦或黄豆幼根根尖。 实验方法 一、线粒体的超活染色与观察 线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态的数量随不同物种、不同 组织器官和不同的生理状态而发生变化。 詹纳斯绿 B 是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的。 （一） 人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察 1.取清洁载玻片放在 37恒温水浴锅的金属板上，滴 2 滴 1/5000 詹纳期绿 B 染液。 2.实验者用牙签宽头在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取上
13、皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色 10-15min(注意不可使染液干燥，必要时可再加染液) ，盖上盖玻片，用吸水纸吸去周围溢出的染液，置显微镜下观察。 3.在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高位镜或油镜进行观察，可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。 (二) 小白鼠肝细胞线粒体的超活染色观察 1.用颈椎脱臼法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的肝组织一小块，放入表面皿内。用吸管吸取 Ringer 液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。 2.在干净的凹面载玻片的凹穴中，滴加 1/5000 詹纳绿 B 溶液，
14、再将肝组织块移入染液，注意不可将组织块完全淹没，要使组织边缘染成蓝绿色即成（一般需染 20-30min）。 3.吸去染液，滴加 Ringer 溶液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散出。然后，用吸管取分离出的细胞悬液，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片进行观察。 4.在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，可见具有 1-2 个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。 (三) 洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的超活染色观察 1.用吸管吸取 1/5000 詹纳斯绿 B 染滴，滴一滴于干净的载玻片上，然后，撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色 10-15min
15、。 2.用吸管吸去染液，加一滴 Ringer 液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。 3.在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤至一侧贴细胞壁处。仔细观察细胞质中线粒体的形态与分布。 二、液泡系的超活染色与观察 中性红为弱碱性染料，对液泡系（即高尔基体）的染色有专一性，只 将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。 （一） 蟾蜍胸骨剑突软骨细胞的液泡系中性红染色观察 软骨细胞能分泌软骨粘蛋白和胶原纤维等，因而粗面内质网和高尔基 都发达，用中性红超活染色后，可明显地显示出液泡系。 1.将蟾蜍处死，剪取胸骨剑突最薄的部分一小
16、块，放入载玻上的 1/3000 中性红染液滴中，染色 5-10min。 2.用吸管吸去染滴，滴加 Ringer 液，盖上盖玻片进行观察。 3.在高倍镜下，可见软骨细胞为椭圆形，细胞核及核仁清楚易见，在细胞核的上方胞质中，有许多被染成玫瑰红色大小不一的泡状体，这一特定区域叫“高尔基区”，即液泡系。 （二） 小麦根尖细胞液泡系的中性红染色观察 1.实验前，把小麦种子或黄豆培养在培养皿内潮湿的滤纸上，使其发芽，胚根伸长到 1cm以上。 2.用双面刀片把初生的的小麦或黄豆幼苗根尖( 约 1-2cm 长) 小心切一纵切面，放入载玻上的 1/3000 中性红染液滴中，染色 5-10min。 3.吸去染液，滴一滴 Ringer 液，盖上盖玻片，并用镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察。 4.在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡。占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。 从以上的观察结果，想想植物细胞液泡系的形态演进情况。
