1、深部真菌感染的实验室检测,卫生部北京医院细菌室 胡云建,由于大量使用广谱抗生素，器官移植、导管介入、肿瘤的放疗和化疗、免疫抑制剂的使用等使得真菌的感染呈现上升的趋势。,1983年美国调查念珠菌为第9位血液感染的病原体。然而在美国49家医院的一个三年(19951998)对血液感染病原菌监测中发现，只有凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和肠球菌的发生率高于念珠菌，即念珠菌已成为第4位血液感染的病原菌（见表1）。,表1 美国49家医院19951998血液感染病原菌的分布,近年来，还有报道在美国的一些医院真菌感染占阳性血培养的10-15%。 同时，真菌感染为艾滋病的重要死亡原因之一。 引起深部真菌感染
2、的病原菌主要有白色念珠菌、曲菌和隐球菌等。,由于目前临床大量使用抗真菌药物，不但使感染菌种发生了迁移，而且造成耐药性上升。,深部真菌菌种的变化,菌名 85-92年 () 96-2002年(%) 白念珠菌 80-90 43-75 热带念珠菌 10-13 10-15 近平滑念珠菌 1-6 14-21 光滑念珠菌 3-4 12-24 克柔念珠菌 1 5-27 葡萄芽念珠菌 1 2-5 新型隐球菌 1 1-5,前10位真菌对氟康唑的敏感性,菌名 株数 S SDD R% 白色念珠菌 38833 98.4 0.7 0.8 近平滑念珠菌 2628 93.8 4.4 1.8 热带念珠菌 2990 92.5 4
3、.9 2.6 葡萄芽念珠菌 274 93.4 3.3 3.3 新型隐球菌 688 89.1 4.8 6.1 念珠菌属 2583 81.2 10.7 8.1 季也蒙念珠菌 365 78.6 12.9 8.5 其它念珠菌 1158 75.3 11.3 13.4 光滑念珠菌 5611 65.5 20.1 14.4 克柔念珠菌 1206 17.7 31.1 50.7,作为临床医生应了解当前真菌感染的现状和耐药趋势，以便合理用药。为了更好的治疗真菌感染的病人，现简要地介绍深部真菌感染的实验室检测情况，以供大家参考。,一、培养方法,传统方法：接种沙保弱培养基，阴性结果培养7天。鉴定：厚膜孢子白色念珠菌芽管
4、实验白色念珠菌生化小管 编码鉴定法：API20C, VITEK等,真菌显色培养基： 用传统分离方法将标本接种在真菌显色培养基上，37C培养24-48小时，不同念珠菌可对发色底物进行水解作用，从而形成不同颜色的菌落，通过观察菌落颜色，便能快速分离和鉴定临床上85%以上的常见的念珠菌，其中对白色念珠菌和热带念珠菌鉴定的正确率可达95%以上。目前已有多家公司（bioMerieux公司，CHROMagar公司等）生产的商品试剂。,二、非培养方法,（一）、免疫学方法检测真菌感染 近年来，用于检则真菌的抗原、抗体及代谢产物的免疫学检查已用于深部真菌感染的实验室检测，并已成为这一领域研究的热点。目前的免疫学
5、检查主要针对真菌胞壁或胞内成分，但尚无一种方法的敏感性和特异性令人满意，如能结合两种以上方法进行检测，则可明显提高诊断的准确性。,念珠菌,烯醇化酶(Enolase) Cand-Tec抗原 ：Cand-Tec抗原乳胶凝集试验是第一个商品化检测念珠菌抗原的试剂盒（美国，Ramco Laboratories）。该方法的敏感性和特异性分别达到76.5%和87.5%。 -（13）-D-葡聚糖(Glucan) ：目前有日本Seikagaku公司生产的商品试剂盒。（也包括曲菌等） 甘露聚糖(Mannan) ：目前已有Bio-Rad公司生产的商品试剂盒。实验时间为2小时。实验的敏感性和特异性分别达到80%和9
6、3%。,隐球菌,荚膜多糖抗原 ：荚膜多糖抗原是隐球菌的荚膜内含特异性的多糖抗原，可用乳胶凝集试验进行检测。目前已有多家公司生产商品乳胶凝集试剂盒，在脑脊液标本检测中使用得较多。,曲霉菌,半乳甘露聚糖(Galactomannan) 半乳甘露聚糖是曲霉菌感染的特异抗原。目前已有的商品试剂盒，例如Bio-Rad公司生产Platelia，实验的敏感性和特异性分别达到93%和95%，但也有文献报告假阳性率高达18%。,（二）、代谢产物检测方法,D-阿拉伯醇可作为侵袭性念珠菌病的诊断标记物，可在病人的血液和尿中检出。检测方法主要有两种：化学分析法和色谱法。实验的敏感性和特异性分别达到70%和86% D-甘
7、露醇是侵袭性曲霉菌和隐球菌的代谢产物之一。但D-甘露醇是否可以作为此两种真菌感染的标记物，有待于进一步的研究。,（三）、分子生物检测方法：,分子生物检测方法目前主要采用PCR法或以PCR法为基础再加上其它方法，如分子杂交、酶免方法、种特异性探针、限制性内切酶、荧光毛细管电泳，即先用真菌通用的引物对临床标本进行扩增，再对扩增产物分析来鉴定是何种真菌，主要用于无菌部位标本的检测。对于其它类型的标本，该方法不能很好区分是感染菌或是定植菌。,三、真菌药敏实验,肉汤稀释法：金标准敏感试验,NCCLS M27- A （1997），然后对于霉菌提出M38-A文件，制订肉汤宏量和微量稀释法的标准指南。 培养基
8、： RPMI1640粉MOPS（三氮吗啡林丙磺酸）缓冲液稀释 优点：有较好的重复性和稳定性 缺点：操作复杂,推荐三种适合医院的临床微生物实验室开展酵母样真菌药敏实验。,抗真菌的试条法（Etest） ATB FUNGUS 2 真菌药敏纸片扩散法,抗真菌的试条法（Etest）试验,Etest试条由瑞典AB BioDis生产，可用于酵母菌和霉菌的药物检测。 培养基：采用RPMI1640琼脂，在RPMI1640肉汤的基础上添加1.5%Bacto Agar。 操作：接种液浊度0.5麦氏浊度，贴试条35C培养24-48小时。 优点：它综合了稀释法和纸片扩散法的优点，手工操作简单，不需要仪器，抗生素选择灵活
9、，有较好的重复性和稳定性操作简便 可以直接获得最小抑菌浓度（MIC）结果， 缺点：试条昂贵的价格限制了在临床的常规应用。,表3 三种药物对念珠菌属的最小抑菌浓度（MIC）结果解释指南,ATB FUNGUS 2,由法国bioMerieux公司生产的ATB FUNGUS 2真菌药敏试剂条，其原理以NCCLS建议标准方法-肉汤稀释法为基础，完成对氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑和伊曲康唑四大主要抗真菌药物敏感性实验 。,ATB FUNGUS 2,ATB FUNGUS 2,步骤：将准备好的待测酵母菌的悬浮液转移到培养基中，并接种到试条上。在有氧条件下35C (+ 2C)的环境中，念珠菌属要培养24小时(+
10、2 小时)，新型隐球菌要培养48小时(+ 6 小时)。,ATB FUNGUS 2 ：读结果,ATB FUNGUS 2 ：读结果,对于两性霉素B，最小抑菌浓度（MIC）应该判断为生长完全受抑制的测试杯的浓度（即得分为“0”的测试杯） 对于氟康唑（FCA）, 伊曲康唑（ITR）和 氟胞嘧啶（5FC），鉴于可能存在拖尾生长，最小抑菌浓度（MIC）对应的测试杯得分可以是“2”，“1”，或是“0”分。 对于两性霉素B （Amphotericin B (AMB)），MIC 2 mg/l，解释为耐药，(新型隐球菌通常的MIC为0.5和1 mg/l。),ATB FUNGUS 2,ATB FUNGUS 2 ：特
11、点,此方法使用标准微孔稀释法，易检出耐药菌株，重复性达到99%， 不需要特殊实验设备，就可完成真菌药敏检测，可靠实用。 质量控制：为了保证所描述方法的标准化，应使用指定用于此试条的试验菌株来进行质量控制,（三）、真菌药敏纸片扩散法,1美兰纸片扩散法 ：已用于全球多中心真菌的耐药监测，2003年NCCLS已确认该方法，制订了氟康唑和沃尔康唑质控菌株的参考范围及氟康唑的抑菌环判断标准。,试验设备：352的孵箱，0.5号麦氏管 试验试剂： 1、氟康唑（大扶康）25g/片，沃尔康唑1g/片。未开封的纸片-14保存. 2、无菌棉拭子 3、无菌生理盐水 4、 葡萄糖,美兰, Mueller-Hinton琼
12、脂,美兰纸片扩散法,制备葡萄糖美兰M-H琼脂平皿：MH琼脂 1000ml美兰贮存液 100ul葡萄糖 20g美兰贮存液制备： 100mg美兰加20ml无菌水。高压15分钟，121灭菌。55 倒4mm厚平皿。 M-H琼脂中含2%葡萄糖和0.5ug/ml美兰。,美兰纸片扩散法,步骤： 制备酵母菌悬液：挑取大约菌落至5ml生理盐水中，比浊至0.5号麦氏管， 酵母菌量约为15106个/ml。 接种平皿:在菌悬液中浸湿无菌棉签，在试管内壁液面上方通过旋转棉签挤出多余的酵母菌液。 用棉签从3个不同的方向均匀涂布平皿。,美兰纸片扩散法,待琼脂吸收菌菌液约5-15分钟后。贴氟康唑（25g/片）和沃尔康唑（1g
13、/片）纸片，轻压，确保纸片贴在琼脂表面上。 孵育：35孵育20-24h后读取结果，24h生长不足，只能延长至48h。,美兰纸片扩散法,真菌纸片扩散法,氟康唑解释标准和相应的最小抑菌浓度,美兰纸片扩散法,标准菌株20-24h抑菌环直径（mm)的质控允许范围 标准菌株 氟康唑25ug 沃尔康唑1ug白念珠菌 ATCC90028 28-39 31-42 近平滑念珠菌ATCC22019 22-33 28-37 热带念珠菌 ATCC750 26-37 克柔念珠菌 ATCC6258 16-25,真菌药敏纸片法 （丹麦ROSCO公司）：,已用于全球多中心真菌的耐药监测。 其特点：操作简单，成本低，抗生素选择
14、灵活，与NCCLS认可的肉汤稀释法有良好符合率和有完整的结果判读。,真菌药敏纸片法（丹麦ROSCO公司）：,其方法如下：将改良SHADOMY琼脂平皿置35干燥20-25分钟，吸1.0ml接种液（5105CFU/ml）涂布均匀，用移液管吸走多余的液体，平皿在35干燥10分钟，贴纸片。一般对于酵母菌培养18-24小时后观测结果，隐球菌属应在30培养42-48小时观测结果。通过抑菌圈判断敏感(S)、剂量依赖性敏感(SDD)和耐药(R)。,基本抑菌圈判读标准,Hu Yunjian,纸片药敏结果与Etest 结果符合的情况,两种方法的符合率为92.8%( 敏感株277，剂量依赖性敏感株29，耐药株30，合计336株)，在不符合的26株菌中，Etest有5株为敏感，其MIC值多为6或8，纸片药敏法则为SDD; Etest有18株为SDD, 纸片药敏法则为R, Etest有3株为R,其纸片药敏法为SDD。,表1 285株深部真菌标本分布,菌种分布情况,白色假丝酵母133株(46.7%)、光滑假丝酵母66株(23.2%)和热带假丝酵母54株(18.9%),表2 285株真菌对三种抗真菌药物的药敏试验结果,由于临床医生需要了解当前真菌感染的现状和耐药趋势，以便合理用药。为了更好的治疗真菌感染的病人，有条件的实验室应积极开展对真菌鉴定和药敏监测工作，拿出当地的数据。,
