1、第十五章 流式细胞仪分析技术及应用,授课教师：程真珍 学时数：2学时,教学目的： 掌握流式细胞仪免疫分析的基本原理和技术要点，熟悉其参数与数据显示方式，了解流式细胞仪分选原理。 教学要求：1.掌握流式细胞分析技术的基本原理；流式细胞分析术常见术语：前向散射光（FS）、侧向散射光（SS）、流式细胞术定义、荧光补偿和同型对照抗体；流式细胞分析的样本制备，荧光免疫反应、仪器校准和免疫检测质量控制。2.熟悉流式细胞仪的基本组成结构：液流系统、光路系统和数据处理分析系统；流式细胞仪分析软件的数据显示方式及其应用：各种直方图及其设门方式；流式细胞分析仪免疫分析的样本的制备、荧光染料的选择与荧光标记；流式细
2、胞术在免疫学检查中的应用。3.了解流式细胞仪分选原理。免疫胶乳颗粒技术原理及应用。,教学重点与难点 重点：流式细胞仪分析中不同荧光染料的特点，流式细胞仪检测中不同层次的质量控制要求及流式细胞仪在免疫学中的应用。 难点：流式细胞仪免疫分析的基本原理和技术要点。,流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。,流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。,细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、
3、灵敏、定量,流式细胞术的特点,流式细胞术发展史,1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究 1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞 1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白 1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利 1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞 1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器 1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 1972年Her
4、zenberg研制出细胞分选器 1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂 大量厂家不断生产流式细胞仪,流式细胞术发展史,目前国内主要流式细胞仪厂家：Beckton Dickinson(BD)公司BACKMAN COULTER公司,流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。,第一节 流式细胞仪的分析及分选原理,流式细胞仪常检测的细胞特性,采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率； 利用荧光染料
5、与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性； 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。,一、流式细胞仪分析的工作原理,（1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统,（一）流式细胞仪的基本组成结构：,由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。,（1）液流系统,液流系统示意图,FCM的液流系统（如何形成单个细胞流
6、）,样本管,鞘液管,激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜，将激光器发射的激光束聚焦成椭圆光斑 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光） FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）,（2）光学系统,光学系统示意图,主要由计算机及其软件组成,（3）数据处理系统,（二）基本工作原理,基本过程,流式细胞仪与显微镜的区别,通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。,二、细胞分选原理,压电晶体,产生机械振动,不充电,充电,（一）分选基本原理,分选
7、速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。,（二）分选的技术要求,参数：FS,SS,FL 散射光的测定 荧光测量 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、三参数直方图、流式细胞仪的多参数分析 ） 设门分析技术,第二节 数据的显示与分析,FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少,一、 参
8、数,细胞在液柱中与激光束相交时向周围360立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。,二、散射光的测定,前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.510)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。,前向散射光示意图,侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。,侧向散射光示意图,测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分
9、析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。,淋巴细胞,单核细胞,中性粒细胞,光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群,荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 线性放大器和对数放大器,三、荧光测量,荧光染料的特性,激发波长(EXCITING) 发射波长(EMISSION),荧光补偿,单参数直方图 双参数散点图:点图二维等高图假三维等高图 三参
10、数直方图 流式细胞仪的多参数分析,直方分析图,设门分析:REGION和GATE设置,四、数据显示方式,由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,（一）单参数直方图,单参数直方图,双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。 双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,（二）双参数直方图,1.双参数散点图,双参数散点图,2. 二维等高图,由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。 等
11、高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞数愈多。 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。,二维等高图,3. 假三维等高图,（三）三参数直方图,多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。,（四）流式细胞仪的多参数分析,AIDS病人T细胞亚群分析,Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。,根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。,五
12、、设门分析技术,A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞,A、B、C均为任意门,线性门,Region设置: 区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。,D1 CD4+/CD3- D2 CD4+/CD3+ D3 CD4- /CD3- D4 CD4- /CD3+,如十字门分析时，起就可以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。,样本制备 标记染色 免疫胶乳颗粒技术 质量控制,第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求,外周血淋巴细胞样品的制备分离单个核细胞培养细胞的样品制备蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗涤 尼龙网过滤,一、
13、免疫检测样品制备,新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法 酶处理法 化学试剂处理法 表面活性剂处理法单细胞悬液的保存 深低温保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（2周） 甲醛或多聚甲醛保存法（2月）,适用条件: 有较高的量子产额和消光系数 对488nm的激发光波长有较强的吸收 发射光波长与激发光波长间有较大的波长差 易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性,二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色,激光,细胞悬液,异硫氰酸荧光素,得州红,能量传递复合染料,藻胆蛋白类,（一）几种常见的荧光染料,常用的几类荧光染料,用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后
14、产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。,能量传递复合染料,488nm,575nm,670nm 红色荧光,花青苷5,藻红蛋白,能量传递复合染料机制,荧光染料与细胞成分的四种结合方式结构亲和式嵌入结合共价键结合荧光标记抗体特异性结合免疫荧光标记方法直标:干扰少,但需购买多种单抗间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体组合标记,（二）免疫荧光标记,免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快
15、，所以又有“液相芯片”之称 。,三、免疫胶乳颗粒技术的应用,微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码）,通过对标记不同荧光素分子的检测，实现FCM对可溶性物质的定量分析,适当的制备方式 处理红细胞 实体组织来源标本用机械法 温度2537，pH7.07.2,四、流式细胞免疫学技术的质量控制,（一）单细胞悬液制备的质控,温度 pH 染料浓度 固定剂,（二）细胞悬液免疫荧光染色的质控,光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状
16、态。绝对计数校准: 保证计数的准确性。,Flow-check,Flow-set,Flow-count,（三）仪器操作的质控,同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。 全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。,（四）免疫检测的质控,流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。,第四节 流式细胞术在免疫学检验中的应用,T淋巴细胞及其亚群分析Th(CD3+CD4+CD8-T)
17、; Tc(CD3+CD4-CD8+T) B淋巴细胞及其亚群分析B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体 NK细胞分析NK(CD3-CD16+CD56+),一、淋巴细胞及其亚群的分析,细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例) 细胞内细胞因子测定,二、淋巴细胞功能分析,三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型,对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型 用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变,CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例,MDR(+)表示对化疗药物耐药,四、肿瘤耐药相关蛋白
18、分析,五、艾滋病检测中的应用,HLA-B27可出现在58%97%的强直性脊椎炎(As) 患者,六、自身免疫病相关HLA抗原分析,七、移植免疫中的应用,FCM作为一个强大的技术平台，已应用于多个领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛。目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞术的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和群体反应性抗体（Panel reactive antibody, PRA）检测。,思考题,流式细胞技术中使用的鞘液主要用于（） A.维持被测细胞的功能 B.维持被测细胞的活性 C.保持被测细胞的形态 D.保持被测细胞处于样本流的中间
19、E. 保持被测细胞与外部环境pH值相同 2.SS信号主要用于检测细胞的哪一项（） A.表面属性 B.发光效能 C.内部结构 D.外部形态 E.表面分子特征 3.对同一个物体，FS信号的强弱的表达哪项正确（） A.与细胞的体积大小成反比 B.与细胞的体积大小成正比 C.与细胞的自发荧光成反比 D.与细胞的自发荧光成正比 E.与细胞内结构的复杂程度成正比 4.流式细胞仪的数据参数是指仪器采集的用于分析的信号，包括（） A.前向散射光、侧向散射光、速率散射光 B.前向散射光、荧光、侧向散射光 C.侧向散射光、速率散射光、荧光 D.前向散射光、侧向散射光、可见光 E.前向散射光、速率散射光、荧光,思考
20、题,5.用于流式细胞技术分析的细胞必须符合的基本条件是（） A.细胞的pH在正常水平 B.具有生物学活性 C.单个细胞 D.固定后细胞 E.两个或两个以上相连的细胞 6.对工作环境pH变化最敏感的染料是（） A.德克萨斯红 B.FITC C.罗丹明X D.藻红蛋白 E.别藻青蛋白 7.流式细胞仪的光路与流路校正评价，CV值不应超过（） A.5%-10% B.10%-15% C.15%-20% D.20%-25% E.25%-30% 8.流式细胞仪分析最关键的第一步是（） A.荧光染料的选择 B.制备单细胞悬液 C.仪器各参数的设定 D.单克隆抗体的选择 E.反应条件的确定 9.下列关于辅助性T
21、细胞的描述不正确的是（） A.表达CD3+CD4+CD8-的T细胞 B.受自身MHC类分子限制 C.能辅助B细胞分化成熟生成抗体产生细胞，参与促进细胞免疫应答 D.根据其产生的细胞因子类型不同又可进一步分为Th细胞的亚群 E.同时具有细胞活化辅助效应和自身免疫效应作用,思考题,10. 一年轻患者，出现腰骶关节疼痛，伴有腰部活动受限，临床医生高度怀疑强直性脊柱炎（AS），请问哪项实验室血样本检测可作为辅助诊断项目（） A.RF B.CCP C.HLA-B27 D.AKA E.ASO,小 结,流式细胞术（FCM）是在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号实现对
22、单个细胞进行定量分析或纯化分选。 FCM分析中前向散射光反映颗粒的大小；侧向散射光反映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度；荧光反映颗粒被染上荧光部分数量的多少，根据其标记的抗原分子不同，即反映了不同抗原分子的表达情况。 同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，可使荧光标记单抗的信号保持其特异性。 对各项工作环节和仪器性能进行严格的质量控制和规范化操作，是保证FCM分析中各项检测数据和指标可靠性的关键。,1.王兰兰.临床免疫学与检验.第3版.北京：人民卫生出版社，2003. 2.王兰兰，吴健民.临床免疫学与检验.第4版.北京：人民卫生出版社，2007. 3.王建中.临床流式细胞细胞分析.上海：上海科学出版社，2005.,参考文献,
