1、抗体纯化及纯度的检测,林 英生物技术学院 2012.11.27,抗体纯化的方法,超速离心分离是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度密度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适宜少数大分子物质的分离。【其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分离法、Ficoll分离法（聚蔗糖泛影葡胺液 ）。 】选择性沉淀选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境。核酸去除法盐析沉淀法有机溶剂沉淀法高分子聚合物沉淀法 例： 50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白；8%12%PEG6000可沉淀IgG。,超滤法利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛。层析法 凝胶过滤、离
2、子交换、亲和层析IgA相对分子量160,000，IgM相对分子量1000,000，故可通过分子筛将两者分开而得到纯品。电泳 SDS-PAGE,一、硫铵盐析法简便、蛋白质变性较少，33%饱和度的硫铵可以沉淀所有各类免疫球蛋白；缺点是分离的纯度较差，对IgA类抗体来说，浓盐可使其形成二聚体，不宜采用。,一、原理 当高浓度盐存在时，蛋白质表面的电荷基团和极性基团与溶液中的离子配对，瓦解了以电荷为基础的蛋白质-蛋白质相互作用。加之高盐能促进蛋白质表面疏水区的相互作用，形成蛋白质聚集体，并从水中分离析出沉淀。这一技术称为“盐析”。不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀，所以盐析常用于蛋白质的粗分离纯化。硫
3、酸铵是分级沉淀蛋白质的一种极有用的盐，它具有保护蛋白质的活性、pH范围广、溶解度高、溶液散热少和经济适用等一些优良性质。 硫酸铵浓度常以百分浓度表示。以X%表示所要配制的溶液浓度，X0%表示开始的溶液浓度，所需的硫酸铵克数按以下公式计算：g=515 (X- X0)/(100-0.27X) (0时1L溶液),操作步骤 将硫酸铵晶体在乳钵中研磨成粉末状； 将盛有5ml蛋白质溶液（血液或消化液）的烧杯放在另一装有冰水的溶器内，并置于磁力搅拌器上搅拌； 加5mL生理盐水，边搅拌，边徐徐加入1.06g硫酸铵粉末至20%饱和； 在4放置1h后，用8000g离心20min； 取上清液转入另一烧杯，放在冰水的
4、溶器内，在磁力搅拌器上边温和搅拌，边加入3.84g硫酸铵粉末至80%饱和； 4放置2h后，用8000g离心20min； 弃去上清液，取0.5 mL 生理盐水溶解沉淀； 装入透析袋，用0.0175mol/L PBS（pH 7.4）透析1d，期间换透析液6次。,二、Cohn冷酒精沉淀法：,凝胶过滤 ( 分子筛) 层析,三、层析分离,离子交换层析法,三、层析分离,四、硫铵盐析和DEAE-纤维素柱层析法纯化IgG在pH7.5的溶液中IgG带正电，其他血清蛋白带负电，因此阴离子交换剂DEAE-纤维素可以一次将IgG提纯到很高的纯度,四、IgM的纯化方法：18%饱和度硫铵沉淀+DEAE-纤维素柱层析法。,
5、将透析管剪成适当长度（1020cm）的小段，即透析袋。 2. 在大体积的2（m/V）碳酸氢钠和1mM EDTA（pH8.0）中将透析袋煮沸10min。 3. 将透析袋用蒸馏水彻底漂洗。 4. 将透析袋置于1mM EDTA（pH8.0）中煮沸10min。（也可将透析袋放在广口瓶中充满水，松动瓶盖，于20 psi 高压灭菌10min。） 5. 待透析袋冷却，存放于4，应确保透析袋始终浸没在液体中。 6. 使用前用蒸馏水将透析袋里外加以清洗。,透析袋的处理,鉴定： 鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、纯度以及免疫学活性 蛋白的含量定氮（紫外光280nm等） 分子的质量电泳、质谱 蛋白的纯度电泳等 免疫学活性免疫双扩散、免疫印迹,免疫血清的保存：,1. 4保存（6个月） 2. 低温保存（-70 -20 ，5年） 3. 真空干燥保存（5 10年）注意点：保存前需经除菌保存液含防腐剂避免反复冻融（分装）,谢谢！,
