1、细胞凋亡及细胞周期检测,汪 艳,细胞DNA含量的分析 (Analysis of Cell DNA Content),DNA含量检测是流式细胞仪应用最早、且目前仍然广泛应用的指标之一。恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，有很多研究证明DNA含量分析对人肿瘤的诊断预后有很高的价值。DNA含量分忻还可提供细胞信息，所以它也可作为细胞生物学的一种有用的工具。尤其对细胞毒性药物的研究很有价值。DNA含量常和某种细胞周期相关蛋白同时检测，来分分析细胞处于某一特定周期阶段。,利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等) 与细胞内DNA碱基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流
2、式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量,细胞DNA分析原理,细胞周期与DNA的倍体关系,0,200,400,600,800,1000,PI Fluorescence,DNA Analysis,2N,4N,肿瘤组织中二倍体细胞作为细胞DNA含量分析的内参标准，癌组织都应该含有一定比例的正常二倍体细胞，这是因为： 癌组织源于正常组织，可能残存一些同源组织正常细胞； 癌组织的血液供应和支持组织往往是从正常组织延伸过来的，存在一些成纤维细胞、血管内皮细胞及血细胞等； 由于机体免疫监视功能，有大量浸润的淋巴细胞、巨噬细胞等。且在癌组织DNA直方图上，异倍体峰前总可以见到1个或大或小的二倍体
3、峰位的G0/1细胞峰。另外，显微图像分析仪做倍体检测时，都采用组织中淋巴细胞做对照。,G2,M,G0,G1,s,0,200,400,600,800,1000,s,DNA Analysis,DNA content,Count,Normal Cell Cycle,Normal/Abnormal Cell Mix Population,DNA的倍体和DNA指数的关系,DNA倍体性Ploidy：细胞内染色体DNA含量 二倍体Diploid：正常体细胞内染色体DNA含量 DNA指数（DI）：测定标本的G0/G1期细胞DNA含量与同种系正常细胞的G0/G1期细胞DNA含量的比值，表示细胞倍体性 S期含量S
4、PF：S期细胞占总周期细胞的比例 增殖指数PI：增殖细胞（SG2M）占总周期细 胞的比例 G0/G1期细胞DNA含量变异系数CV,Cell Cycle Not Simplely Put,1. 出现非整倍体细胞峰， DI1.1或DI15% 3. 无明显的异倍体，但G0/1的CV10%，S期在10% -15% 4. S+G2/G1/0 20%,DNA诊断肿瘤病标准(Klein et al),DNA分析的临床意义,DNA倍体分析：辅助诊断/早期诊断肿瘤结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细
5、胞的分析，意义尤为重要。监测疗效判断预后,细胞DNA分析的意义 DNA非整倍体的出现是癌前病变发生癌变的一个重要指标。癌前病变是指有癌变潜能的病变。临床上所谓的癌前病变所包括的实际上是一大组生物学行为迥异的病变,其中的一小部分有潜在的癌变可能,而大部分完全是良性病变.依靠病理形态分析,可根据分级将其区分,但易受病理医师的经验限制,会得出截然不同的结论。用FCM分析细胞DNA含量,可提供较确切,可靠的信息。DNA的非整倍体出现与癌变率和癌前病变增生程度有关,是癌前病变发生癌变的一个重要指标,DNA 非整倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指标: 良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非整倍体细胞
6、而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞,实体瘤以超二倍体或多倍居多。实体恶性肿瘤的非整倍体出现率70%,淋巴瘤和白血病以亚二倍体居多,出现率达50%。交界性肿瘤形态学介于良恶性之间,难于监别。如果交界性肿瘤出现异倍体即已具有恶性特征,尽管病理形态学尚不能证实,也应视为恶性。,观察病情演变 探讨化疗药物的作用机制和疗效分析。 判断预后 非整倍体的肿瘤 恶性程度高，复发率高，转移率预后差。 近二倍体和二倍体肿瘤 : 预后好。但少数肿瘤的DNA分析对预后无判断价值。S期细胞比例评估肿瘤恶性程度和预后有意义,高S期肿瘤一般比低S期对化疗敏感。,肿瘤实体瘤标本的FCM检查耐药基因检查癌基因与抗癌基因在肿瘤细胞中的
7、表达及与预后的关系粘附分子检查细胞凋亡检查细胞DNA及细胞周期分析(癌前病变,恶性肿瘤预后评价)细胞增殖能力研究 肿瘤细胞耐药性筛选肿瘤相关抗原，特异标志物激素受体与癌细胞生物行为有关的因子，如CD44,常用荧光染料的特性,荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红 PeCy5 488 675 免疫荧光 红 PI 488 620 DNA染色 橙红 PECy7 488 755 免疫荧光 深红 PerCP 488 670 APC 633 670,流式细胞
8、术检测细胞周期和凋亡实验 PI单染检测步骤,器材：EP管、EP管架、离心管、加样器及滴头、37水浴箱、 碎冰 试剂：实验用细胞（1106/ml ）；PI综合染液 (PI 0.1mg/ml, TritonX-100 0.1%, NaCl 0.9%)；70%冰酒精（PBS配制）；RNA seA(mg/ml)；0.01M /L PBS ；300目尼龙网 操作步骤： 将实验用细胞制备成1106/ml浓度，离心弃上清，用预冷70-75%酒精1-2ml固定（4h或过夜）； 第二天取出后用0.01M/L PBS, PH7.2离心洗涤（5001000rpm/min 5-10 min ）1-2次，弃去固定液,
9、加入RNase A（终浓度1mg/ml）6080ul /管, 振荡混匀 。37水浴30分钟； 置冰上2分钟终止RNAse作用； 加入PI综合染液1ml/管，振荡混匀，4冰箱避光保存小时。300目尼龙网过滤，转入FCM测量管。 上机检测，结果分析.,注意：1、细胞量一定要1106/ml。2、必须保证被检测样品为单细胞悬液,。3、如果样品细胞为培养的贴壁细胞，将上清转入离心管（其中含有脱落的凋亡细胞），与胰酶消化的细胞合并后离心收集细胞。4、PI综合染液不能用蒸馏水配，否则细胞全部溶解，造成结果不可靠。,去除粘连细胞，因粘连可导致细胞呈4N，利用Peak值与积分信号比值在单细胞均1的关系，去除粘连
10、细胞。,去除粘连细胞步骤： PI波长630，FL3：Lin，Peak/Aux（附加信号） 采取SysIILismodel 分析DNA改用另一软件：Muticycle 测DNA设Protocol：可用CD3、4、8的方案 FL3：Lin，Peak；Sig：Aux 设门阈值：Aux FL3 Peak 3040 C门内为G0G1值（FL3值）200，D门内为G2、M值（4N）,正常全血图形：,分析DNA含量样品的制备,PI或EB荧光染色方法，目前市场已有剂盒出售，十分方便；但也可以自己配制试剂。PI综合染液做细胞DNA含请“一步法”染包： PI综合染液的配制：生理盐水1296 ml，PI 10 mg
11、、RNase 2 mg、1.0Triton Xl00 0.5 ml、枸橼酸钠200 mg、加蒸馏水至200 ml，凋pH 7276，置4C冰箱中避光保存备用。 将单细胞悬液或加固定液细胞悬液离心沉淀弃上清，用PBS洗涤2次，调细胞浓度为1106，加l ml PI综合染液； 髓4冰箱，染色2030 min；离心洗上PI染液，加少许PBS液，上机检测。,细胞凋亡研究,1.鉴别凋亡与坏死:Annexin /PI2.测定凋亡率:Annexin 、Apo 27、TUNEL3.研究凋亡触发机制：Caspase、Fas及FasLbcl-2/bax 4.多参数分析凋亡是趋势,Annexin 磷脂结合蛋白作为探
12、针识别细胞膜表面磷脂酰丝氨酸一、原理：细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞膜内部的磷脂酰丝氨酸（PS）可以迁移到细胞外层表面。巨噬细胞就是通过识别凋亡细胞表面的PS将凋亡细胞或凋亡小体吞噬，保护机体避免因细胞内部暴露引起的炎症反应。Annexin 是一种Ca离子依赖的，对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别细胞膜是否有PS，识别凋亡细胞，由于坏死细胞也可能在膜表面出现PS，故需要同时进行染料（PI）排斥实验，凋亡细胞膜完整，不能染色。,早期细胞凋亡的流式细胞术检测Annexin V-FITC/PI,二、试剂与仪器 1）NaCl，5mmolL 2)标记液将FITCAnnexin V(宝
13、灵曼公司产品)和PI加入到孵育缓冲液中，终浓度均为lmg几。3)流式细胞仪。,三、操作步骤： (1)细胞收集：悬浮细胞直接收集到10mi的离心管中，每样本细胞数为(15)X105个L，以5001000rrain离心5分钟，弃去培养液。 (2)用孵育缓冲液洗涤1次，以5001000rmin，离心5分钟。 (3)用100pI的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育1015分钟。 (4)以5001000rrain离心5分钟，沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。 (5)加入荧光(AnnexinFITC)溶液，4下孵育20分钟，避光并不时振动。 (6)流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515n
14、m的通带滤器检测FITC荧光，用另一波长大于560nm的滤器检测PI。 (7)结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有拒染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染，产生红色荧光，而细胞膜保持完好的。细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-PI-)；右上象限示非活细胞，即坏死细胞，为(FITC+PI+)；而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC + PI-)。,细胞膜非对称性和通透性检测,-TG不同时间（0、6、12、18、24h)诱导HL-60
15、细胞凋亡（Annexin v),早期细胞凋亡的流式细胞术检测APO2.7 受到凋亡诱导后，线粒体膜电位（MMP)会发生变化，导致膜穿透性的改变。常用的阳离子绿色荧光染料罗丹明123（Rh123)可在正常活细胞的线粒体内聚集。当细胞MMP降低，Rh123则减少。线粒体膜电位发生变化外，线粒体功能紊乱是细胞发生凋亡的关键，其膜蛋白7A6的暴露是细胞早期凋亡的标志之一。Apo2.7是一种新抗体，它与凋亡细胞线粒体膜所暴露的7A6蛋白起反应，但在正常健康细胞或活化细胞无表达。 这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。,细胞核内DNA断裂标记分析（ TUNEL 法，ISNT法）细胞凋
16、亡过程中细胞核内的DNA出现断裂，断裂点暴露出 DNA分子的残端，用末端转移酶(TdT)或者缺口连接酶都可以标记上可以识别的化学物质。标记DAN断裂的3羧基末端，常采用由 DNA聚合酶 I催化的原位缺口转移(in situ nick translation， ISN)或用TdT介导的dUTP原位缺口末端标记 (terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)技术。1SNT和 TUNEI法均可进行间接或直接标记， 直接法：标记物通常是生物素化脱氧三磷酸尿苷(biotindUTP)或地高辛Di
17、gdUTP等； 间接法：标记物常为异硫氰酸荧光素FITCdUTP。间接标记还需链霉亲合素FITC或抗DigFITC，使标记反应倍增，其灵敏度较高，但比直接标记复杂。,晚期细胞凋亡的流式细胞术检测TUNEL法,晚晚期细胞凋亡的流式细胞术检测DNA 含量分析凋亡的细胞因核酸内切酶的活性增强，使DNA分裂成一些小片段，这些小片段因细胞膜的通透性的增加而漏出胞外，使凋亡细胞的 DNA含量相对减少，因此在DNA的直方图上出现一个位于 G1峰左侧的小峰（亚G1峰），称为AP峰。坏死及其它原因引起的细胞碎片则形成不规则的峰形，紧靠于Y轴右侧。FCM的DNA分析检测细胞凋亡存在一定的局限性。比如，机械处理的肿
18、瘤标本常有许多碎片，在 DNA直方图上出现较宽的杂信号峰，使凋亡细胞被“淹没”其中，不少文献将G1峰前的所有信号均算为凋亡细胞，可能会过高计算凋亡细胞的数量；另外，多倍体肿瘤中的低倍体细胞和凋亡的细胞也无法鉴别，这样使所得结果的准确性受到很大的影响。由于亚G1峰是DNA断裂后胞浆内含量减少的结果，因此在评价细胞早期凋亡时，该指标不够灵敏。,细胞凋亡的流式细胞术检测Hoechst-PI 一、基本原理弥补PI检测凋亡细胞不足，Hoechst可被活细胞摄取，与DNA结合在紫外光下呈蓝色荧光。继后PI使死细胞着染产生红色荧光。因此在细胞二维直方图上根据红蓝两种荧光可分辨三种细胞：正常活细胞对染料有拒染
19、性，蓝色和红色荧光均较少，凋亡细胞有膜通透性改变，主要摄取Hoechst染料，表现卫强蓝色荧光，弱红色荧光；死细胞由于有很强的PI嗜染性并覆盖Hoechst染色，呈弱蓝色强红色荧光。 二、检测方法： 1。试剂及配制 （1）PI :100ug/ml(2) Hoechst 33342(33258) :100ug/ml(3)0.01mol/L PBS pH7.0-7.2,2.仪器：流式带351nm激光光源 3.操作方法： （1）制备单细胞悬液 （2）加入Hoechst 溶液，终浓度1ug/ml, 37水浴7分钟(3) 冰上冷却，离心弃染液，PBS重悬。 （4）加入PI染液，终浓度5ug/ml,试管置
20、冰上。 （5）离心弃染液，PBS洗一次后，上机检测。紫外激光检测400500nm处蓝色荧光和大于630nm处红色荧光。,早早期细胞凋亡的流式细胞术检测 半胱氨酸蛋白酶3检测法,半胱氨酸蛋白酶3(caspases一3)是细胞凋亡信号转导通路中的ICE蛋白酶家族的重要成员，在细胞凋亡发生的早期被激活。ICE家族主要通过两种途径来引起细胞凋亡的发生： 细胞毒T细胞(CTL)活化后大量表达Fas配体(Fas L)，Fas L和靶细胞表而的Fas结合，通过Fas分了胞内段的死亡结构域，激活半胱氰酸蛋白酶8，再激活一系列半胱氨酸蛋白酶，引起死亡信号的逐级转导，最终激活内源性DNA内切酶，使核小体断裂，并导
21、致细胞结构毁损，细胞凋亡。 CTL细胞颗粒胞吐释放颗粒酶，可借助穿孔素构筑的小孔穿越细胞膜，激活另一个半胱氮酸蛋白酶10引起半胱氨酸蛋白酶级联反应，使靶细胞凋亡。不管是由半胱氨酸蛋白酶8还是由半胱氮酸蛋白酶10启动的半胱氨酸蛋白酶级联反应，都要经过半胱氩酸蛋白酶3而向下逐级级联。因此，临床常用半胱氨酸蛋白酶3来检测早早期的细胞凋亡。,Caspase Activity-caspase-3 activation,Jurkat T-cells treated with VP16,细胞凋亡调控基因表达产物的FCM检测细胞凋亡与细胞增殖、分化一样，也受着基因的调控。大量的实验研究证明，凋亡与细胞内多种信
22、使及多种癌基因蛋白有关，凋亡的信息是通过一系列信息传导通路到细胞而启动细胞凋亡的，已知凋亡调控基因可分为两大类： 1)诱导基因：如 C-MYC、野生型 P53基因、AP0-1或 Fas基因等。 2)抑制基因：如bcl-2、bcl-x、Cab-l、突变的 P53基因、ras基因等。,p53基因是一个抑癌基因。分为 野生型(Wildtype) 突变型(Mutatin type)，,野生型P53是一种诱导细胞凋亡的基因，可使细胞停止增殖，使 DNA受损细胞停止倍增，得以修复，如若修复失败，以凋亡方式使损伤细胞死亡，故野生型 P53是细胞内的“分子警察”。当细胞受到某种药物或放疗作用后，造成细胞 DN
23、A的损伤，受损细胞启动共济失调毛细血管扩张突变基因 (gene mutated in ataxia-telangiectasia， ATM)使 P53表达增加，引起细胞 Gl期阻滞以完成修复或进入凋亡以清除肿瘤细胞，野生型P53还可逆转变异细胞为正常细胞。因此是一个研究最深入的一个抗癌基因。已有学者提出并进行了基因治疗肿瘤，诱导细胞凋亡，对这方面的研究已进行了有意义的探索。在许多恶性肿瘤中发现p53基因缺失和突变，并有突变P53蛋白表达增高。,突变型P53不但抑制野生型P53诱导细胞凋亡的作用，还可以拮抗CMYC基因引起凋亡。增强细胞的增殖活性，促发细胞癌变。,bcl-2基因bcl2基因被发现
24、是在淋巴瘤细胞第18号染色体断裂点t(14，18)附近，bcl-2基因蛋白定位表达于线拉体膜上。研究证明，bcl2基因蛋白表达，可以抑制细胞凋亡，故称其为“抗凋亡基因”。它的抗凋亡机制是因为bcl2基因蛋白能够增强线粒体膜电位，抑制线粒体钙离于的释放，使核酸内切酶无法活化，而具有抗凋亡作用。,有作者用FCM研究发现，bcl2基因的表达，可以阻止各种化疗药物引发的白血病细胞的凋亡，bcl2蛋白表达的程度与白血病细胞的多抗药性有关，bcl2基因拮抗化疗药物引起的凋亡和耐药，主要是干扰了氧化自由基的产生。Bcl-2是bcl-2家属中的其中一员，此外还有bcl-xl 、bcl-xs 、bax、 bad
25、、bag-1、 bak等，其中bax、bak、bad、bcl-xs是促凋亡基因，bcl-xl、bag-1是抑凋亡基因。,Fas/FasLFas又称Apol或CD95，FasL(Fas Ligand，Fas配体)又称cD95L。目前的研究认为， FasL是死亡因子， Fas则是它的受体，当一个细胞的FasL与另一细胞的Fas结合时，可以导致表达Fas的细胞凋亡。,ras基因：是细胞凋亡的一个抑制基因，有研究认为，它抑制细胞凋亡是通过ras蛋白产物的高表达来抑制细胞凋亡过程中的核酸内切酶的活性。研究发现，ras蛋白的表达多在肿瘤发生的早期增高，认为ras癌基因在肿瘤的发生过程中最早被激活。还发现越恶性度高，生长快的肿瘤，ras基因蛋白表达增高。这也说明ras基因具有抑制细胞凋亡，促进肿瘤生长之作用。,C-MYC基因：CMYC基因是调控细胞增殖的主要基因，CMYC本身是个转录因子，它与DNA结合，故此与细胞增殖分化及细胞癌变具有密切关系。 CMYC基因是细胞癌变过程中早期表达的基因。但CMYC高表达的同时又可诱导细胞凋亡的过程发生，故此有人将CMYC基因列入细胞凋亡的诱导基因范畴。 CMYC诱导凋亡的特点之一是需要生长因子的缺乏。已有作者研究证实，激发细胞增殖和诱导细胞凋亡的MYC基因具有相同的结构或功能域的重叠，因此，CMYC基因对细胞凋亡常有双重作用。,
