1、1,用于活体影像技术稳定转染肺癌细胞系的建立及体外验证,2,一，研究背景及目的： 癌症极大的威胁着人类的健康，世界卫生组织最新数据表明，到2010年，癌症将成为导致人类死亡的第一病因。中国是世界上肺癌患者最多的国家，根据卫生部公布的统计资料，我国肺癌的死亡率已经高达30.83/10万，与30年前相比上升了465%，肺癌已取代肝癌成为中国首位恶性肿瘤死亡原因。因此,对肺癌转移的研究已成为当前的热点之一,利用免疫缺陷动物建立人类肿瘤动物模型正是研究肿瘤转移生物学和抗转移实验治疗的重要工具.,3,活体成像技术可以利用活体生物发光或荧光成像直接检测活细胞在动物体内的生物学行为。荧光素酶（Lucifer
2、ase）是一种常用的信号分子，可以用来标记肿瘤细胞，在活体成像技术中也得到了广泛的应用。研究表明带有Luciferase 基因的肿瘤细胞在动物体内成瘤之后, 借助于灵敏的活体成像系统, 通过检测Luciferase 发光强度, 可间接反映出细胞的数量、肿瘤的大小和肿瘤转移位置。活体成像技术已经成为近年来动物模型研究最重要的进展。,4,本研究采用PRC/CMV2luc+/neo质粒转染人非小细胞肺癌细胞株A549，经G418筛选后获得稳定表达荧光素酶的单克隆细胞株A549- luc+，经体外及体内相关生物学特性鉴定，探讨这些经荧光素酶修饰的细胞株是否可作为活体监测肿瘤转移及药物治疗疗效的模型,为
3、肺癌生长及转移机制的研究和药物开发提供了新的有用工具。,5,6,1. PRC/CMV2- luc+ 载体的构建及鉴定 用限制性内切酶对PGL3-Promoter质粒和PRC/CMV2质粒进行双酶切，酶切位点为Hind和Xba。将从PGL3-Promoter质粒上酶切得到的luciferase基因（大约1.7kbp）和PRC/CMV2质粒酶切产物（约5.5kbp）进行连接。对新构建的真核表达载体PRC/CMV2- luc+双酶切鉴定。,7,2. 稳定抗性克隆细胞的获得及荧光素酶活性测定： 取对数生长期的A549细胞，转染前一天将细胞接种于6孔板，24h内待细胞融合度达到70%-90%即可转染。转
4、染按照LipofectamineTM试剂操作手册进行操作。每孔Lipofectamine2000 8ul,质粒DNA4ug.转染后细胞置于培养箱常规培养。,8,转染24h后根据预实验选定的G418筛选浓度加入G418（设立三个浓度梯度：800ug/ml,900ug/ml,1mg/ml,两个复孔），同时以相同的密度传代未转染的细胞作为对照。每天观察细胞，根据细胞死亡情况和培养基的营养状况及时换液和换药。如此重复操作，大概10-14d左右，待对照组细胞全部死亡后，即初步得到单个细胞的克隆。将经过G418筛选初步得到的单克隆A549- luc+细胞（48个）接种到24孔板，接种密度为1105/孔，,
5、9,24h后裂解细胞，收集裂解物，各取10ul加入96孔白板中，每个克隆细胞设2个复孔。每空加入50ul荧光素酶底物，96孔板荧光光度计测荧光值（RLU）。比较RLU值的高低，从高往低留取8个RLU值较高的单克隆细胞继续传代培养，其余的淘汰。细胞每传5代就检测一次，每次检测保留RLU值比较高而且稳定的克隆细胞。重复此筛选过程，直至细胞传代至第40代为止，即可得到稳定表达荧光素酶的A549- luc+细胞。,10,将最终筛选得到的A549- luc+细胞消化，D-Hanks制成细胞悬液，细胞计数后，每孔100ul加入96孔白板中，以每孔1105，5104，2.5104，1.25104，5103，
6、1000，100的细胞数接种于96孔板，设置3个复孔。24h后用D-Hanks冲洗后加入D-Luciferin底物，使终浓度为150ug/ml。室温避光放置2-3min后利用活体成像系统观察，并比较平均光密度值和总光子数与细胞数之间的相关性。,11,3. Luciferase基因表达的检测： 分别提取未转染PRC/CMV2- luc+质粒的A549细胞和转染PRC/CMV2- luc+质粒但荧光素酶值比较低的A549-luc+细胞以及经过筛选最终得到的稳定表达荧光素酶的A549- luc+细胞的RNA，逆转录后，做荧光定量PCR检测，比较三种不能细胞株之间luciferase基因的表达差异。,
7、12,4.裸鼠皮下移植瘤模型的建立及动态观察： 裸鼠，4-5周龄，体重（162g），雌性。取对数生长期的A549-luc+细胞，每只接种2106个细胞/100ul于裸鼠右侧前肢近腋部皮下 ，共接种三只。用德国BERTHOLD公司的活体成像系统观察肿瘤的生长情况。观测时小鼠先腹腔注射戊巴比妥那麻醉（计量为：50mg/kg），待小鼠麻醉后，腹腔注射荧光素酶底物D-Luciferin（125mg/kg）10min后成像观察。每隔3-4天观测一次，连续4周。,13,三.实验结果： 3.1 PRC/CMV2- luc+质粒载体的构建及鉴定： 用限制性内切酶Hind和Xba消化构建好的PRC/CMV2-
8、luc+质粒，切出1653bp的片段，1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。,14,1:Marker DL15000；2: Hind和Xba酶切的PGL3-Promoter载体；3: Hind和Xba酶切的PRC/CMV2- luc+质粒；4: Hind和Xba酶切的PRC/CMV2空载体,图1 PRC/CMV2- luc+酶切鉴定,15,3.2 稳定表达荧光素酶的A549细胞系（A549-luc+）的建立及鉴定： 通过浓度梯度实验确定A549细胞的G418筛选浓度为1000ug/ml，细胞转染PRC/CMV2- luc+质粒后经此浓度的G418筛选，一共得到48个单克隆。将初步得到的单克隆细胞
9、继续扩大培养，并不断传代。每隔5-10代检测一次荧光素酶的活性，每次留取荧光素酶活性较高低的克隆，直至细胞传,16,至30代后，得到荧光值较高的三个克隆。其中A549-luc+ clone7的荧光值最高，其次为A549-luc+ clone6 和A549-luc+ clone1。A549-luc+ clone2的荧光值在第5代的时候最高，达到1404444，但是当细胞传至低10代和20代后显著下降，分别为353052和122743。A549-luc+ clone8的荧光值在细胞传至第5代、10代、20代时荧光值一直都比较低，结果如图2所示。所以当细胞传至20代后淘汰A549-luc+ clon
10、e2和 A549-luc+ clone8。而未转染PRC/CMV2- luc+质粒的A549细胞克隆的荧光值为53，检测背景值为45，均明显低于A549-luc+ clone的荧光值。我们选取荧光素酶活性最高的A549-luc+ clone7，检测不同细胞数与光子数之间的相关性（图3）。,17,Passage 图2：Identification of luciferase activity in different A549-luc clone cells at different passage。,RLU(106),18,R L U,19,图3：The Photons of differen
11、t cell densities.,20,细胞体外放光能力检测,21,分析结果显示A549-luc+ clone7的相关系数R为0.990，表明光子数与细胞数有非常强的相关性。因此，通过体外荧光素酶活性检测和体外细胞发光能力的检测，初步鉴定了A549-luc+ clone7为稳定表达Luciferase基因的阳性克隆。,22,3.3 A549-luc+clone细胞luciferase基因的检测: 分别提取A549-luc+ clone7，A549-luc+ clone1和A549 parental 细胞的总RNA后逆转录，荧光定量检测luciferase基因的表达。结果显示在A549-luc
12、+ clone7里luciferase基因的表达是A549 parental的27.65倍，A549-luc+ clone1则是A549 parental的25.23倍，A549-luc+ clone7中luciferase基因的表达是A549-luc+ clone1的22.34倍。说明了在稳定克隆中luciferase基因的表达要明显高于假阳性克隆和A549母细胞。,23,3.4 裸鼠皮下移植瘤模型的建立：A549-luc+ clone1，A549-luc+ clone6，A549-luc+ clone7细胞分别皮下接种裸鼠，活体成像监测肿瘤细胞在体内的生长情况，分别在接种的7，11，15，
13、18，22，25d观察肿瘤的生长情况。结果如图4所示。接种一周后就能看到绿豆大小的肿瘤突起，随着时间的延长，肿瘤的体积和荧光信号逐渐增强，其中A549-luc+ clone7的荧光信号最强，A549-luc+ clone6次之，A549-luc+ clone1 最弱。随着接种天数的增加，,24,A549-luc+ clone1和A549-luc+ clone6在第18天荧光信号开始减弱，平均光密度值开始下降，某些区域荧光信号则消失，究其原因，是随着肿瘤细胞的增值、分裂而导致新增肿瘤细胞荧光素酶基因的丢失。而A549-luc+ clone7的信号继续增强，但是到了第28天荧光信号也开始减弱，平均
14、光密度值下降。所以分析该实验结果，认为A549-luc+ clone1和A549-luc+ clone6是个假阳性克隆，不能用来构建用于活体成像的小鼠肺癌移植瘤模型。而A549-luc+ clone7则可以用于小鼠肺癌移植瘤模型的构建。,25,Clone1Clone6clone7,7d,18d,25d,Color bar Max=6.5105 Min=3500,26,四：结论生物发光成像（BLI）技术是近年来发展起来的一种新的技术方法，为研究肿瘤的治疗及分子发生机制提供了一种非常有效的方法，被广泛应用于肿瘤转移，基因治疗，流行病学的发病学等相关研究。荧光素酶是广泛表达于萤火虫体内的一种基因，因
15、为具备无毒、成像时间短、背景低、半衰期短等优点而被广泛应用，它可以和体外导入的荧光素底物发生反应，产生近红外波长的荧光，穿透深层组织，是一种理想的活体成像信号分子。利用luciferase标记的活细胞进行活体成像，能够更好的发现肿瘤的复发、转移及治疗效果的评价，提高了肿瘤检测的灵敏性。,27,本实验通过转染PRC/CMV2luc+/neo质粒构建表达荧光素酶的A549细胞株，通过G418反复筛选，细胞传代一直到第40代，再经过荧光素酶活性检测和体外细胞发光能力检测，初步选取了荧光素酶活性较高的三个克隆：A549-luc+ clone1，A549-luc+ clone6和A549-luc+ cl
16、one7进行裸鼠皮下成瘤模型的建立，活体成像观察肿瘤的生长情况。实验观察发现，虽然三株克隆细胞都是经过G418筛选，并且传代达到40代，而且荧光素酶活性也比较高，但是在裸鼠皮下成瘤性能上还是有比较大的差异。A549-luc+ clone7细胞皮下成瘤不论是在肿瘤的生长速度，体积,28,大小，荧光信号强弱和持续的时间等方面都要好于A549-luc+ clone1和 A549-luc+ clone6。所以通过细胞皮下成瘤能力比较进一步验证了A549-luc+ clone7为阳性克隆并且具有较好的成瘤能力，适合于小鼠肺癌移植瘤模型的建立。但是随着接种时间的延长，肿瘤体积的增大，由于小鼠负荷的加大以及肿瘤血液供应不足，导致肿瘤内部中心区域出现坏死，A549-luc+ clone7的荧光信号从第28天开始也会逐渐减弱，这提示了我们小鼠成瘤模型的观察最好在一个月以内完成。,29,本研究将活体成像技术与肺癌的研究想结合，并建立了稳定整合luciferase的人非小细胞肺癌A549-luc细胞系，体内外实验证明具有很好的稳定性和发光性，并且建立了小鼠肺癌移植瘤模型，为肺癌的生长转移机制研究及抗癌药物的研发提供了很好的细胞株和动物模型。,30,Thank you !,31,32,33,34,35,36,37,。,38,39,40,41,
