1、四川大学华西医院 吕晓菊,深部真菌感染诊断相关问题,深部真菌感染 流行现状 药敏解读 早期诊断技术 诊断策略, Systemic fungal infections, SFI -真菌入侵血流,造成严重感染. -可以是条件致病真菌攻击免疫低下患者; 也可以是特殊地理区域致病真菌引起的感染, 如组织胞浆菌、青霉菌 或 球孢子菌. -异于表浅真菌感染,SFI可致命.,深部真菌感染定义,SFI的发生 -接触或吸入孢子，真菌在体内或体表过长 -尤多见于免疫功能低下者,深部真菌感染,SFI类别 - 念珠菌病 Candidiasis 最常见 常源于 patients own body. 口炎 Thrush.
2、 肠炎 Enteritis 阴道炎 Vaginitis heart valves, urinary tract, eyes, or blood. - 曲霉菌病 Aspergillosis, 肺炎常见，可侵犯肾脏、中枢,深部真菌感染, SFI类别 - 隐球菌脑膜炎 Cryptococcal Meningitis 大脑与脊髓发炎 慢性脑膜炎 -卡氏肺胞菌肺炎 PCP: Pneumocystis Pneumonia, Caused by Pneumocystis jiroveci. - 青霉菌病 penicillium marneffei,深部真菌感染, SFI类别 -芽生菌病 Blastomyco
3、sis, a lung infection that may spread through the bloodstream; -球孢子菌病 Coccidioidomycosis, also known as San Joaquin or valley fever; -毛霉菌病 Mucormycosis, which can develop into a very serious, life-threatening infection; -组织胞浆菌病 Histoplasmosis,深部真菌感染,侵袭性真菌感染 Invasive fungal infections, IFI,深部真菌感染,深部真
4、菌感染 流行现状 药敏解读 早期诊断技术 诊断策略,念珠菌菌血症,在成人ICU成为严重的问题1978：在院内菌血症第5位最常见的分离菌株Ann Intern Med, 89;91-1061999：在院内菌血症第4位最常见的分离的菌株CID , 29;239-2442002：严重的真菌感染(第)超过了其他细菌感染Bioorg Med Chem，10；11531170,白念珠菌（2957例）,热带念珠菌（674例）,TTC-沙保培养基（SDA）,热带念珠菌（紫色）,光滑念珠菌（647例）,克柔念珠菌（154例）,烟曲霉（342例）,黄曲霉（165例）,血液标本分离的真菌构成情况,226例,脑脊液标
5、本分离的真菌构成情况,29例,泌尿生殖道标本分离的真菌构成情况,790例,呼吸道标本分离的真菌构成情况,4987例,肺泡灌洗液标本分离的真菌构成情况,126例,隐球菌脑膜炎与禽鸟的关系,53例均为散发,发病前有养鸽、养鸟、或养鸡史及家禽接触史者有30例占发病总数的51.51%其余23例病人与禽鸟类无明显接触史。,刘巧 吕晓菊 等 中国感染与化疗杂志 2007; 7(1): 56,深部真菌感染 流行现状 药敏解读 早期诊断技术 诊断策略,作用于细胞膜的抗真菌药物,Cell membrane Polyene antibiotics- Amphotericin B, lipid formulatio
6、ns- Nystatin (topical) Azole antifungals- Ketoconazole - Itraconazole - Fluconazole- Voriconazole- Posaconazole- Miconazole, clotrimazole (and other topicals),影响细胞壁、核酸合成的抗真菌药物,Cell membrane Polyene antibiotics- AMB NST Azole antifungals- FCZ ITR VRZKCZ MCZ,DNA/RNA synthesis Pyrimidine analoguesFlucy
7、tosine,Cell wall （New） Echinocandins -Caspofungin acetate (Cancidas)-Micafungin,真菌天然耐药,氟康唑 克柔念 Candida krusei 光滑念 Candida glabrata 曲霉菌 毛霉菌 荚膜组织胞浆菌依曲康唑 毛霉菌 伏立康唑 接合菌 （Zygomycetes） 卡泊芬净 新型隐球菌 两性霉素B 土曲霉菌 葡萄牙念珠菌、枝顶孢霉、尖端赛多孢、足分支霉、白吉利毛孢子菌,后天耐药,氟康唑 非白念依曲康唑 ？伏立康唑 ？卡泊芬净 ？,医学重要的酵母菌分类 Segal B, Bow EJ, Menichetti
8、 F: Infect Dis Clin N Am 2002;16:935-64,主要念珠菌,白色念珠菌 C. Albicans 热带念珠菌 C. Tropicalis 光滑念珠菌 C. glabrata 克柔念珠菌 C. Krusei 近平滑念珠菌 C. Parasilosis 葡萄牙念珠菌 C. lusitaniae 都柏林念珠菌 C. dubliniensis 季也蒙念珠菌 C. guilliermondii 乳酒念珠菌 C. Kefyr,氟康唑 5-氟胞嘧啶 伊曲康唑 # 两性霉素B* 伏立康唑S 8 4 0.125 0.5 1SDD 16-32 - 0.25-0.5 - 2I - 8-
9、16 - -R 64 32 1 1 4,NCCLS M27-A 1997 抗真菌药物对酵母菌的MIC判定折点（ug/ml）,#粘膜中酵母菌 ；*非 NCCLS标准; CLSI未公布对念珠菌的折点,纸片扩散法敏感试验的判定标准,SSusceptible SDD=Susceptible-Dose Dependent R=Resistant,全球氟康唑对Candida glabrata 的敏感性,Pfaller MA, ISHAM, 2003,常见念珠菌体外敏感性评估,S=敏感 S-DD=剂量依赖敏感 I=中介 R=耐药 Pappas PG et al, Clin Infect Dis 2004;3
10、8:161-89; Bartizal K et al, Antimicrob Agents Chemother 1997;41:2326-32; Patterson TF. J Chemother 1999;11:504-12; Pfaller MA et al, Antimicrob Agents Chemother 2002;46:1723-7; Pfaller MA et al, J Clin Microbiol 2002;40:852-6,真菌室培养阳性率最高的丝状真菌,曲霉菌属：185种，约20种被报道过，其中烟曲霉、黄曲霉是常见的致病菌可从痰、支气管灌洗液、血、脑脊液、角膜刮出物、
11、外耳道、鼻窦、腹膜液、玻璃体中分离到,常见的致病曲霉种,烟曲霉（A.fumigatus） 黄曲霉（A.flavus） 构巢曲霉（A.nidulans） 黑曲霉（A.niger） 土曲霉（A.terreus） 棒曲霉（A.clavatus） 杂色曲霉（A.vewsicolor）,曲霉的药敏感试验与临床疗效,Aspergillus spp, from 29 patients with IA 黄曲霉 A. flavus 41% 土曲霉 A. terreus 31% 烟曲霉 A. fumigatus 28% A. terreus MIC was consistently high Pts with i
12、solates with MIC 2 ug/ml died,Lass FlorIC ，JAC 1998,Etest 试验结果,土曲霉,Aspergillus fumigatus - Microscopic Morphology, 100x Lactophenol cotton blue (单列) 分生孢子头、分生孢子梗、顶囊、瓶梗、分生孢子,28株烟曲霉 的体外敏感性,28株烟曲霉 的体外敏感性,Aspergillus flavus - Microscopic Morphology, 100x Lactophenol cotton blue ( 二列为主)分生孢子头、分生孢子梗、顶囊、瓶梗、梗
13、基、分生孢子,18株黄曲霉 的体外敏感性,18株黄曲霉 的体外敏感性,Aspergillus niger - Colonial Morphology, Sabouraud agar黑曲霉菌,黑曲霉菌(背面),9株黑曲霉的敏感性,9株黑曲霉的敏感性,Aspergillus nidulans- Colonial Morphology, Sabouraud agar 构巢曲霉菌,4株构巢曲霉的敏感性,4株构巢曲霉的敏感性,Aspergillus terreus - Colonial Morphology, Sabouraud agar 土曲霉菌,4株土曲霉的敏感性,4株土曲霉的敏感性,医学重要的霉菌
14、分类 Segal B, Bow EJ, Menichetti F: Infect Dis Clin N Am 2002;16:935-64,霉菌,曲霉菌属,非曲霉菌属,烟曲霉,非烟曲霉,黄曲霉 黑曲霉 土曲霉,镰刀霉茄病镰刀霉尖孢镰刀霉,接合菌根霉属毛霉属根毛霉属梨头霉属小克银汉霉属,暗色孢霉链格孢霉属万氏霉属双极菌属弯孢属,91例AIDS 37株PM菌 敏感株 S % MICg/ml 伊曲康唑 36 97.3%（36/37） 0.002 两性霉素B 35 94.6%（35/37） 0.002 氟康唑 32 86.5%（32/37） 2 酮康唑 29 78.4%（29/37） 0.042 5-
15、氟胞嘧啶 27 73.0%（27/37） 0.05,马尔尼非青霉菌,广州: 宋伟南 曾泳而 陈万山 2003-2004,深部真菌感染 流行现状 药敏解读 早期诊断技术 诊断策略,病原学诊断,两主体 三层次整体水平 蛋白质水平 核酸水平病原体 直接涂片 Ag 测定 DNA病原体分离 RNA 人 体 Skin Test 特异Ab测定 Biopsy,重要真菌感染部位与表现,John R. Wingard，IDSA， 2005,肝移植 临床表现,侵袭性念珠菌病( Invasive Candidiasis)常 见 少见而严重腹腔脓肿 脑膜炎腹膜炎 骨髓炎切口感染 化脓性关节炎血行感染 心内膜炎尿路感染
16、肝脾念珠菌病胆道感染 永久失明 (C.endophalmitis),Paul E Marik , Expert Opin. Pharmacother; 2006; 7( 3):297-303,1.Conventional microbiological 培养技术 culture based microbiological assays 非培养技术 Non-culture based microbiological assays 2.Histological 涂片 切片 3.Radiological 胸部CT扫描 Pulmonary CT scan were the cornerstone of
17、 diagnosis,诊断技术,非培养的方法 1.直接涂片:2.抗原：Cryptococcus, HistoplasmaAspergillus：半乳甘露聚糖（Galactomannan） 3.抗体：针对某些地方性真菌病4.PCR 用于 Candida, Aspergillus（实验阶段）5.组织病理检测,病原学诊断,真菌直接涂片的诊断价值,诊断阳性率高 BALF培养阳性率40，涂片64，涂片培养67(Ann Intern Med 1997, 29: 535; Respir Med 1992, 86:243) 快速:2-4hr可以报告结果 有助于鉴别感染类型 有隔菌丝：曲霉菌属 唑类抗真菌药（伊
18、曲康唑、伏立康唑）有效 无隔菌丝： 根毛霉属、根霉属、毛霉属、犁头霉属、小克银汉霉属 两性霉素B敏感,The lancet, 2003, 3: 230-240,真菌直接涂片的诊断价值,肺毛霉菌病： 真菌培养的阳性率不高 怕“冷” 组织匀浆可能会破坏毛霉菌，“假阴性” 有时，直接涂片是唯一诊断手段 诊断肺毛霉菌病的治疗价值 首选肺叶切除 次选两性霉素B（三唑类抗真菌药无效） 卡氏肺孢子菌：无法体外培养,The lancet, 2003, 3: 230-240,男27 例, 女26 例均经腰穿引流脑脊液检查墨汁染色找到隐球菌为确诊依据最快: 第一次腰穿查见隐球菌（31例）最慢: 第六次腰穿查见隐球
19、菌（6例）平均3次可查到隐球菌,华西医院53例隐球菌脑膜炎,刘巧 吕晓菊 等 中国感染与化疗杂志 2007; 7(1): 56,培养 手工培养方法 价廉 但生长较慢 组织标本查Cryptococcus 与 Aspergillus 价值大 血标本 查 Candida 和 Aspergillus 敏感性差自动培养方法 利于早期诊断、提高敏感性 对Cryptococcus, Histoplasma, Candida 血行感染有价值 对Aspergillus 血行感染无价值,病原学诊断,非培养微生物检查技术GM检测 Detection of circulating galactomannanG试验 D
20、etection of （1，3） -D-glucanMN检测和抗AMN抗体检测 Detection of mannan and anti-mannan AB-PCR检测 Detection of fungal DNA（PCR),标志物 Surrogate markers,曲霉菌细胞壁上一种多聚糖抗原（Galactomannan，GM） FDA 2003年5月批准作为中性粒细胞减少或BMT病人侵袭性曲霉菌感染的诊断方法 敏感性80.7%，特异性89.2% 非侵入性，快速阳性指数 0.5 需序贯测定： 2次/周,抗原检测 曲霉菌 半乳甘露聚糖（GM）,抗原检测,抗原检测在曲霉感染的免疫学诊断中倍
21、受青睐。抗原检测的标本可取血清、尿液、脑脊液及BAL 液等。血清GM在感染后24 h即可检测出,并与病情严重程度一致。抗原检测方法较常用的是EL ISA、RIA 和乳胶凝集试验等。抗原检测的敏感性和特异性因方法而异。 ELISA（BioRad）：敏感性高 1ng/ml Latex agglutination： 15ng/ml由于曲霉感染机体至机体应答产生抗体二周后才有显著升高。抗体检测对侵袭性曲霉感染的早期诊断帮助不大。,在儿童的应用价值？ 食物中的GM可以被吸收，假阳性？ 哌拉西林/他唑巴坦治疗，假阳性？ 非血液病患者应用不多 抗真菌治疗对结果的影响？,半乳甘露聚糖(GM)检测存在的问题,酵
22、母菌、丝状真菌细胞壁成分 检测：念珠菌、曲霉菌、镰刀菌、毛孢子菌、支顶孢属 不能检测：隐球菌、接合菌（根霉与毛霉） 美国FDA已批准，欧洲部分国家已注册 敏感性、特异性：90左右,D葡聚糖 （G试验）,美国大多数研究限于念珠菌菌血症 其他真菌感染（侵袭性曲霉菌病）的研究资料少 假阳性：血液透析；接受血制品治疗（免疫球蛋白） 抗生素对结果的影响 体外假阳性 体内？colistin, cefazolin, ertapenem, trimethoprim-sulfamethoxazole, cefotaxime, ampicillin-sulbactam, and cefepime,1.3-D-葡聚
23、糖（G试验）,1.3-D-葡聚糖测定的正常值,10pg/ml 以下 无真菌感染10-20pg/ml 病情观察期大于20pg/ml 真菌感染,两种试验敏感性、特异性相当 都能早期诊断侵袭性曲霉病，而 -D-葡聚糖可能更早出现 两者结合，可以互补 弥补GM假阴性可能 多用于粒细胞缺乏患者，其他患者有待研究,半乳甘露聚糖(GM) VS -D-葡聚糖（G试验）,烯醇化酶检测,又称2-磷酸-D甘油盐水解酶 研究显示只有在深部白色念珠菌感染时才大量释放烯醇化酶，而寄生在浅表部位的白色念珠菌一般不会释放该酶 抗原检测敏感性和特异性分别为75%和96% （Walsh 等） 抗体诊断深部念珠菌病，其特异性和敏感
24、性分别为96.4%和81.5% （Zller等 ）,四种方法,Mitsutake等-免疫凝集反应检测烯醇化酶，-Cand-Tec系统检测Cand-Tec抗原，-G试验检测beta-葡聚糖，-Pastorex法检测甘露糖， 39例中10例浅表念珠菌感染，10例深部真菌感染。烯醇化酶 Cand-Tec抗原 -葡聚糖 甘露糖特异性 100% 76.9% 84.4% 25.6%敏感性 71.8% 87.5% 87.5% 100%,曲霉菌病肺部CT表现的演变,Caillot et al. J Clin Oncol 2001; 19:253-9,组织病理学检查-病原学诊断,支气管液,气管粘膜,骨髓,深部真菌感染 流行现状 药敏解读 早期诊断技术 诊断策略,确诊侵袭性肺部真菌感染,临床诊断侵袭性肺部真菌感染,拟诊侵袭性肺部真菌感染,IFI的诊断标准 invasive fungous infections,注：有无 肺组织、胸液、血液真菌培养阳性（除肺孢子菌外）,确诊1. 艾滋病（AIDS） 2. 马尼菲青霉菌肺部感染 3. 马尼菲青霉菌败血症,确诊后治疗5-21 两性霉素B 1mg 5-22 3mg 5mg 5-23 10mg 15mg 5-24 25mg 5-23 加用伊曲康唑 0.2 bid至5-24体温降至正常,深部真菌感染SFI IFI增强意识 提高认识,NOTICE,
