1、实 用 医 学 杂 志 2023 年 第 39 卷 第 19 期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.19miR-21-3p/p53 信号通路对缺血/再灌注损伤小鼠的肾脏保护作用及其机制雷小林1 刘燕秀2 张婵31西安交通大学第一附属医院肾脏内科（西安 710000）；2吉安市中心人民医院消化内科（江西吉安 343000）；3西北工业大学医学研究院（西安 710072）【摘 要】目 的 观 察 miR-21-3p 对 肾 缺 血/再 灌 注（ischemia/reperfusion，I/R）损 伤 小 鼠 的 影 响，并 探 讨其
2、肾 脏 保 护 作 用 是 否 与 通 过 miR-21-3p/p53 信 号 通 路 而 调 控 凋 亡 水 平 有 关。方 法 体 内 实 验 随 机 分 为Sham、I/R、I/R+agomir、I/R+agomir+PIF、I/R+PIF 共 5 组。建 立 小 鼠 肾 缺 血/再 灌 注（I/R）损 伤 模 型；构 建过 表 达 miR-21-3p（agomiR-21-3p）小 鼠，同 时 给 予 p53 抑 制 剂 Pifithrin-（PIF）处 理；采 用 双 荧 光 素 酶 报 告 基因 实 验 验 证 miR-21-3p 与 p53 的 互 作；检 测 小 鼠 血 清 中
3、肾 功 能 指 标 小 鼠 胱 抑 素 C（Cys C）、尿 素 氮（BUN）、肌 酐（Scr）的 含 量，以 及 炎 症 指 标 肿 瘤 坏 死 因 子-（TNF-）、白 细 胞 介 素-1（IL-1）、超 敏 C 反 应 蛋 白（hs-CRP）含 量 水 平；此 外，TUNEL 染 色 观 察 肾 细 胞 凋 亡 情 况，并 检 测 肾 组 织（细 胞）匀 浆 中 细 胞 凋 亡 相 关 基 因 p53、Bax、Bcl2、Caspase-3 的 表 达 水 平。结 果 与 Sham 组 比 较，I/R 组 小 鼠 肾 细 胞 miR-21-3p 表 达 明 显 降 低；而 与I/R 组 相
4、 比，I/R+agomir 组、I/R+PIF 组 和 I/R+agomir+PIF 组 miR-21-3p 表 达 均 明 显 升 高（P 0.05），而p53 表 达 趋 势 相 反；双 荧 光 素 酶 报 告 基 因 实 验 证 实 miR-21-3p 与 p53 存 在 互 作 关 系；与 Sham 组 比 较，其 他 肾组 织 细 胞 凋 亡 率 均 升 高；但 是 与 I/R 组 相 比，I/R+agomir 组、I/R+PIF 组 和 I/R+agomir+PIF 组 凋 亡 率 降低，I/R+agomir+PIF 组 损 伤 最 低（P 0.05）。结 论 miR-21-3p
5、可 以 通 过 靶 向 下 调 p53 表 达 来 抑 制 凋 亡 的发 生，从 而 减 轻 肾 I/R 小 鼠 的 肾 损 伤，发 挥 肾 脏 保 护 作 用。【关 键 词】miR-21-3p；缺 血/再 灌 注 损 伤；p53；细 胞 凋 亡【中 图 分 类 号】R363.1+4Protective effects and the mechanism of miR213p/p53 signaling pathway on renal function in mice with renal ischemia/reperfusion injury LEI Xiaolin*，LIU Yanxiu
6、，ZHANG Chan.*Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University，Xian 710000，China Corresponding author：ZHANG Chan Email：【Abstract】Objective To observe the effect of miR-21-3p on mice with renal ischemia/reperfusion（I/R）injury and to explore whether the renal protectiv
7、e effect is related to the regulation of apoptosis levels through miR-21-3p/p53 signaling pathway.Methods In vivo experiments were randomly divided into five groups：Sham，I/R，I/R+agomir，I/R+agomir+PIF，and I/R+PIF.Renal I/R injury model in vivo was established，overexpressing of miR-21-3p（agomiR-21-3p）
8、in mice were constructed and treated with the p53 inhibitor Pifithrin-（PIF）.Dual-luciferase reporter assay was used to verify the interaction between miR-21-3p and p53.Serum levels of cystain C（Cys C），blood urea nitrogen（BUN）and serum creatinine（Scr）were measured to reflect renal function of mice.Se
9、rum oxidative stress and inflammation indices were also determined，including tumor necrosis factor-alpha（TNF-），Interleukin-1（IL-1），and high-sensitive c-reactive protein（hs-CRP）.In addition，apoptosis rate of renal cells was visualized by TUNEL staining and the expression of apoptosis b-cell lymphoma-
10、2（Bcl-2），Bcl-2 assaciated X protein（Bax），p53 and caspase-3 were measured too.Results Compared with Sham group，the expression of miR-21-3p in I/R mice was significantly decreased.Compared with I/R group，the expression of miR-21-3p in the I/R+agomir group，the I/R+PIF group and the I/R+agomir+PIF group
11、 was significantly increased（P 0.05），while the trend of p53 expression was opposite.Dual-luciferase reporter assay confirmed the interaction between miR-21-3p and p53.Compared with Sham group，the rate of cell apoptosis in all other renal tissues was increased；基 础 研 究 doi：10.3969/j.issn.1006-5725.202
12、3.19.011基 金 项 目：国 家 自 然 科 学 基 金-青 年 科 学 基 金 项 目（编 号：82200386）；中 国 博 士 后 科 学 基 金-面 上 项 目（编 号：2022M712590）；陕 西 省自 然 科 学 基 础 研 究 计 划 项 目-青 年 项 目（编 号：2022JQ-881）通 信 作 者：张 婵 E-mail：2475实 用 医 学 杂 志 2023 年 第 39 卷 第 19 期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.19however，compared with the I/R group，
13、the I/R+agomir，the I/R+PIF group and I/R+agomir+PIF groups were decreased，and the I/R+agomir+PIF group was the lowest（P 0.05）.Conclusions miR-21-3p could inhibit the development of apoptosis by targeting p53 expression，thus alleviating renal injury in mice with renal I/R.【Key words】miR-21-3p；ischemi
14、a/reperfusion injury；p53；apoptosis急 性 肾 损 伤（acute kidney injury，AKI）是 一 种常 见 的 综 合 征，定 义 为 肾 功 能 突 然 下 降。AKI 见于 10%15%的 住 院 患 者，甚 至 超 过 50%的 ICU患 者1。更 重 要 的 是，AKI 是 院 内 死 亡 率 的 独 立 预测 指 标，对 于 这 些 幸 存 者 来 说，进 展 为 慢 性 肾 脏 病或 终 末 期 肾 病 的 风 险 很 高，迫 切 需 要 为 已 确 诊 的AKI 寻 找 特 定 的 治 疗 策 略2。肾 I/R 损 伤 是 AKI 的
15、主 要 原 因，其 特 征 是 肾 小 管 致 死 性 和 亚 致 死 性损 伤3-4。研 究5 表 明，肾 小 管 适 应 不 良 和 不 完 全修 复 导 致 肾 纤 维 化 的 进 展。因 此，保 护 肾 小 管 上皮 细 胞（tubular epithelial cells，TEC）免 受 缺 血 性 损伤 和 促 进 肾 小 管 修 复 对 于 改 善 缺 血 性 AKI 的 结 局至 关 重 要。目 前，血 清 肌 酐 和 尿 量 通 常 用 于 AKI 诊 断 和分 期6。然 而，血 清 肌 酐 和 尿 量 的 变 化 在 实 际 肾损 伤 后 发 生 相 对 较 晚，因 此 不
16、 能 提 供 AKI 的 早 期或 及 时 检 测。此 外，血 清 肌 酐 和 尿 量 受 多 种 因 素影 响，如 脱 水、膳 食 蛋 白 质 摄 入 量、肌 肉 质 量、利 尿剂 等7。MicroRNA（miRNA）是 核 苷 酸 的 短 非 编 码RNA 分 子，内 源 性 产 生 以 调 节 靶 基 因 表 达8-9。有趣 的 是，一 些 miRNA 被 释 放 到 细 胞 外 空 间，并 在血 液，尿 液 和 其 他 体 液 中 被 检 测 到，代 表 了 人 类 疾病 的 新 型 诊 断 生 物 标 志 物。与 蛋 白 质 生 物 标 志 物相 比，miRNA 在 体 液 中 更
17、稳 定10-11。此 外，基 于 序列 的 qPCR 扩 增 能 够 以 高 特 异 性 测 量 少 量 体 液 中极 少 量 的 miRNA12-13。在 肾 脏 中，miRNA 与 包 括AKI 在 内 的 多 种 肾 脏 疾 病 的 发 病 机 制 有 关，并 且特 异 性 miRNA 的 表 达 变 化 被 认 为 对 AKI 具 有 诊 断价 值14-15。然 而，目 前 尚 无 具 有 高 灵 敏 度 和 特 异性 的 miRNA 生 物 标 志 物，用 于 I/R 患 者 早 期 检 测AKI。近 期 有 研 究16-17 发 现 miR-21-3p 可 以 减 弱 神经 细 胞
18、 中 缺 氧/复 氧 诱 导 的 细 胞 凋 亡，以 及 减 轻 急性 肺 损 伤，但 miR-21-3p 是 否 参 与 了 I/R 诱 导 肾 小管 上 皮 细 胞 凋 亡，目 前 尚 不 清 楚。肿 瘤 抑 制 因 子 p53 已 成 为 各 种 形 式 的 AKI 的重 要 参 与 者18。这 种 转 录 因 子 主 要 通 过 停 止 细 胞周 期 和 促 进 细 胞 凋 亡 来 响 应 细 胞 应 激 和 DNA 损伤。生 物 信 息 学 分 析 表 明 miR-21-3p 可 能 直 接 靶向 调 控 p53 的 表 达，然 而 其 具 体 作 用 机 制 尚 未 完全 清 楚。
19、在 这 项 研 究 中，证 明 了 miR-21-3p 在 小 鼠 缺 血性 AKI 中 的 生 物 分 布 和 治 疗 益 处。miR-21-3p 积聚 在 受 损 伤 的 肾 脏 中，通 过 下 调 p53 表 达，抑 制 凋亡 来 显 著 减 轻 AKI 的 病 理 损 伤 和 病 死 率，改 善 肾I/R 损 伤，发 挥 了 肾 脏 保 护 作 用，为 预 防 和 治 疗 AKI提 供 新 的 分 子 策 略。1 材 料 与 方 法1.1 材 料 1.1.1 实 验 动 物 实 验 选 取 SPF 级 别 的 C57 BL/6J雄 性 小 鼠（3 4 月 龄，体 质 量 20 26 g
20、），购 买 于西 安 交 通 大 学 第 一 附 属 医 院 实 验 动 物 中 心，饲养 于 西 安 交 通 大 学 第 一 附 属 医 院 肾 脏 内 科 实 验动 物 房，室 内 温 度 控 制 在 22 26，相 对 湿 度为 45%75%，噪 音 60 dB 以 内，12 h 光 照 交 替，定期 消 毒 通 风。动 物 实 验 符 合 伦 理 学（许 可 证 号：202201003）。1.1.2 主 要 试 剂 和 仪 器 Pifithrin-由 MCE 公 司购 买（货 号：HY-123076）；小 鼠 肾 功 能 指 标：半 胱氨 酸 蛋 白 酶 抑 制 剂 C（胱 抑 素 C
21、，Cys C）、血 尿 素 氮（BUN）检 测 试 剂 盒（上 海 沪 震 生 物 科 技 有 限 公司）；血 清 中 肌 酐（Scr）水 平 检 测 试 剂 盒（北 京 九 强生 物 技 术 股 份 有 限 公 司）；炎 症 指 标：肿 瘤 坏 死因 子-（TNF-）、超 敏 C 反 应 蛋 白（hs-CRP）、白 细胞 介 素-1（IL-1）ELISA 试 剂 盒（上 海 酶 联 生 物科 技 有 限 公 司）；细 胞 凋 亡 相 关 蛋 白（Bax、Bcl-2、Caspase-3、p53）抗 体 由 Abcam（英 国）公 司 购 买。AgomiR-21-3p（过 表 达 miR-21-
22、3p）病 毒 由 广 州 锐博 生 物 技 术 有 限 公 司 定 制 完 成。组 织 细 胞 RNA提 取 试 剂 盒（Trizol 提 取 法）（Invitrogen）；反 转 录 试剂 盒、qRT-PCR 试 剂 盒（北 京 全 式 金 生 物 技 术 股 份有 限 公 司）；抗 p53 抗 体（ab26，Abcam），抗 Bax 抗 体（ab32503，Abcam），抗Bcl2 抗 体（ab182858，Abcam），抗 Caspase-3 抗 体（ab184787，Abcam），抗 GAPDH抗 体（ab8245，Abcam）；二 抗：山 羊 抗 兔 IgG（H+L）（CW0103S
23、，康 为 世 纪），山 羊 抗 小 鼠 IgG（H+L）（CW0102S，康 为 世 纪）。ECL 化 学 发 光 液、PDVF膜 购 自 美 国 Millipore。台 式 高 速 冷 冻 离 心 机（5424R，艾 本 德/Eppendorf）；T100 基 因 扩 增 仪（Bio-Rad）；CAX-370 型 离心 机（日 本 TomySeiko 公 司）；SYNERGY/H1 多 功 能酶 标 仪（BioTek）；MX3005P 荧 光 定 量 分 析 仪（Agilent）；BIO RAD GelDoc XR 化 学 发 光 凝 胶 成 像 仪（Bio-Rad 伯 乐）；IX83 荧
24、光 显 微 镜（Olympus）。2476实 用 医 学 杂 志 2023 年 第 39 卷 第 19 期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.191.2 方 法 1.2.1 动 物 分 组 与 给 药 小 鼠 适 应 性 喂 养 后，随 机分 成 Sham 组、I/R 组、I/R+agomir 组、I/R+agomir+Pifithrin-（PIF）组、I/R+PIF，每 组 6 只；除 Sham 组外 均 建 立 肾 I/R 模 型，I/R+agomir 组、I/R+agomir+PIF 组 和 I/R+PIF 组 在 模 型
25、建 立 前 3 d 每 只 经尾 静 脉 注 射 miR-21-3p agomir 10 nmol/L 19，I/R+agomir+PIF 组 同 时 腹 腔 注 射 p53 特 异 性 抑 制 剂PIF（3 mg/kg），共 注 射 3 d20。Sham 组 和 I/R 组 经尾 静 脉 注 射 等 量 PBS 溶 液，在 此 期 间 动 物 自 由 饮食 饮 水。1.2.2 I/R 模 型 建 立 按 照 60 mg/kg 的 剂 量，按 照根 据 小 鼠 实 际 体 重，腹 腔 注 射 1%戊 巴 比 妥 钠 溶液，成 功 麻 醉 后，将 小 鼠 置 于 37 动 物 恒 温 手 术台，
26、取 高 压 灭 菌 后 的 手 术 器 械 于 小 鼠 腹 正 中 线 做 1 2 cm 的 切 口，依 次 切 开 皮 肤 至 腹 膜，而 后 使 用眼 科 镊 在 腹 腔 中 游 离 双 侧 肾 脏 及 肾 蒂，使 用 微血 管 夹 将 双 侧 肾 蒂 夹 闭，开 始 进 行 20 min 倒 计 时，后 快 速 松 开 微 血 管 夹，观 察 到 双 侧 肾 脏 均 由 紫 黑色 转 为 红 色，表 明 再 灌 注 成 功，注 意 无 菌 及 保 暖，关 闭 切 口，依 次 缝 合 小 鼠 腹 部 肌 层 和 皮 层 组 织。假 手 术 组 仅 切 开 腹 膜，游 离 双 侧 肾 脏 及
27、 肾 蒂，不夹 闭 肾 蒂。在 再 灌 注 时 间 点 24 h 后 依 次 麻 醉 小 鼠后 取 材，取 小 鼠 眼 眶 血 及 双 侧 肾 脏，进 行 之 后 的 指标 检 测。按 照 实 验 用 量 切 取 一 定 量 的 肾 组 织 用 4%多聚 甲 醛 固 定，进 行 病 理 染 色。剩 余 部 分 储 存 于-80 的 冰 箱 中 保 存，用 于 基 因 和 蛋 白 的 检 测分 析。1.2.3 细 胞 培 养 及 转 染 将 生 长 状 态 良 好 的 小 鼠肾 小 管 上 皮 细 胞 TCMK1 培 养 于 含 有 10%胎 牛 血清（FBS）和 1%青 霉 素-链 霉 素（P
28、/S）的 DMEM-F12培 养 基，消 化 离 心 重 悬 后 均 匀 地 将 细 胞 接 种 在 6孔 板 内，在 CO2培 养 箱 中 37 培 养 细 胞 过 夜，使 得细 胞 均 匀 贴 壁 生 长。按 照 制 造 商 说 明 书 进 行 细 胞转 染（mimic miR-21-3p 和 miR-21-3p inhibitor 以 及空 载 对 照 NC 由 中 国 上 海 GenePharma 公 司 提 供），第 2 天 查 看 接 种 密 度 和 细 胞 生 长 状 态，达 到 70%融 合 时，使 用 PBS 清 洗 两 遍 后 每 孔 再 加 入 1 mL的 Opti-ME
29、M 无 血 清 培 养 基，细 胞 在 CO2培 养 箱 中37 继 续 培 养 6 h 后 更 换 正 常 DMEM 培 养 基，于转 染 后 48 h 后 观 察 转 染 效 率 并 进 行 指 标 测 定。1.2.4 双 荧 光 素 酶 报 告 基 因 实 验 检 测 miR213p与 p53 的 靶 向 结 合 作 用 根 据 生 物 信 息 学 预 测结 果，针 对 miR-21-3p 上 潜 在 的 p53 结 合 位 点（第635 个 碱 基 位 点），构 建 miR-21-3p 3UTR 的 野 生 型及 突 变 型 荧 光 素 酶 报 告 基 因 质 粒，分 别 与 miR-
30、21-3p 模 拟 物（mimic）共 转 染 到 293T 细 胞 中，以 双 荧光 素 酶 报 告 基 因 实 验 检 测 其 活 性，明 确 miR-150-5p 是 否 与 p53 靶 向 结 合 影 响 其 活 性，以 及 具 体 的结 合 部 位。1.2.5 肾 功 能 指 标 和 炎 症 指 标 的 测 定 体 内 采 用小 鼠 眼 球 采 血 法，分 离 血 清，以 6 000 r/min，离 心10 min，依 据 试 剂 盒 方 法 检 测 血 清 中 有 关 肾 功 能 指标 的 Cys C、BUN、Scr 含 量 水 平 和 炎 症 因 子 TNF-、IL-1 和 hs
31、-CRP 含 量。1.2.6 标 本 采 集 与 肾 脏 细 胞 凋 亡 率 检 查 分 别 处死 小 鼠 并 解 剖 取 出 肾 脏，分 成 两 部 分，一 部 分 于-80 条 件 下 保 存，做 肾 组 织 中 细 胞 凋 亡 相 关 基因 p53、Bax、Bcl-2、Caspase-3 的 检 测；另 一 部 分 于4%多 聚 甲 醛 中 浸 泡 24 h，然 后 使 用 乙 醇 脱 水，切制 成 4 m 厚 的 切 片，并 用 做 TUNEL 染 色，在 荧 光显 微 镜 下 观 察 各 组 肾 脏 细 胞 凋 亡 率。1.2.7 qRTPCR 检 测 肾 组 织 及 细 胞 miR
32、215p 和p53 基 因 表 达 取 各 组 液 氮 保 存 的 右 肾 组 织，RNA 提 取 试 剂 盒 提 取 总 RNA，并 进 行 逆 转 录。PCR引 物 序 列 见 表 1。使 用 TaqMan miRNAs 检 测 试 剂盒 进 行 PCR 反 应。PCR 反 应 条 件：94 30 s，94 5 s，60 30 s，共 40 个 循 环。采 用 2-Ct法 计算 miR-21-5p 和 p53 相 对 表 达 量。各 组 RNA 表 达量 归 一 化 为 对 照 组（NC 或 sham 组）。1.2.8 Western blot 测 定 肾 组 织 凋 亡 相 关 蛋 白
33、表达 体 内 实 验 将 各 组 实 验 小 鼠 肾 脏 组 织 匀 浆，加入 裂 解 液，以 6 000 r/min，离 心 10 min，分 离 并 吸取 上 清 液。BCA 法 测 定 蛋 白 浓 度，进 行 蛋 白 定 量。采 用 Western blotting 检 测 细 胞 凋 亡 相 关 蛋 白 p53、Bax、Bcl-2 和 Caspase-3 表 达，各 组 蛋 白 表 达 量 归 一化 为 GAPDH。1.3 统 计 学 方 法 用 SPSS 22.0 统 计 软 件 进 行 分析。数 据 均 采 用 均 数 标 准 差 表 示，多 组 间 比 较采 用 单 因 素 方
34、差 分 析，组 间 两 两 比 较 采 用 最 小 显著 性 差 异 法（LSD-t 法），以 P 0.05 为 差 异 有 统 计学 意 义。2 结 果2.1 缺 血 再 灌 注 损 伤 导 致 小 鼠 肾 组 织 miR213p下 调 和 p53 表 达 上 调 I/R 肾 组 织 miR-21-3p 表 达低 于 正 常 组，p53 表 达 高 于 正 常 组（P 4倍，图 1A），而 p53 呈 高 表 达（图 1B）。Agomir-21-3p肾 组 织 中 miR-21-3p 表 达 明 显 升 高，p53 表 达 显 著降 低；此 外，与 I/R+agomir 组 相 比，用 p5
35、3 抑 制 剂（PIF）处 理 后，miR-21-3p 反 而 升 高（P 0.05），I/R+agomir 组 与 I/R+PIF 组 未 见 明 显 差 异。2477实 用 医 学 杂 志 2023 年 第 39 卷 第 19 期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.192.2miR213p 靶 向 调 控 p53 表 达 生 物 信 息 学分 析（TargetScan，miRDB，miRTarBase）预 测 显 示，miR-21-3p 与 p53 存 在 互 补 核 苷 酸 序 列（图 2A、B）。双 荧 光 素 酶 报 告
36、 实 验 结 果 显 示，WT-miR-21-3p 与p53 共 转 染 后 的 细 胞 荧 光 素 酶 活 性 降 低，而 MUT-miR-21-3p 与 p53 共 转 染 后 的 细 胞 荧 光 素 酶 活 性 无显 著 变 化（图 2C）。TCMK1 细 胞 qRT-PCR 结 果 显示，miR-21-3p mimic 组 p53 表 达 低 于 NC mimic 组；miR-21-3p inhibitor 组 p53 表 达 高 于 NC inhibitor 组（P 0.05，图2D），图2E 显 示 转 染 效 率 大 约 为80%。2.3 过 表 达 miR213p 小 鼠 可
37、减 弱 I/R 导 致 的 肾功 能 损 伤 与 Sham 组 比 较，I/R 组 小 鼠 血 中 Cys C、Scr 和 BUN 等 反 映 肾 功 能 的 指 标 参 数 水 平 显 著 升 高（P 0.05）；同 时，与 I/R 组 比 较，过 表 达 miR-21-3p小 鼠 血 中 肾 功 能 指 标 含 量 水 平 均 有 不 同 程 度 降 低（P 0.05），过 表 达 miR-21-3p 基 础 上 再 给 予 PIF 处理 后，小 鼠 血 中 肾 功 能 损 伤 指 标 含 量 水 平 降 低 更加 明 显。I/R+agomir 组 与 I/R+PIF 组 未 见 明 显
38、差别。见 图3。2.4 过 表 达 miR213p 而 抑 制 p53 小 鼠 可 以 抑 制炎 症 因 子 的 表 达 与 Sham 组 比 较，I/R 组 小 鼠 血清 TNF-、IL-1 和 hs-CRP 含 量 均 有 增 加（P 0.05）；同 时，I/R+agomir 组 与 I/R+PIF 组 未 见 明显 差 别，但 是 与 I/R 组 比 较，小 鼠 血 中 肾 功 能 指 标含 量 水 平 也 有 不 同 程 度 降 低，而 I/R+agomir+PIF组 则 显 著 降 低 炎 症 因 子 的 产 生。见 图 4。2.5 肾 脏 组 织 细 胞 凋 亡 率 的 检 测 在
39、 荧 光 显 微镜 下，发 现 Sham 组 小 鼠 的 肾 小 管、肾 小 球 等 细 胞，未 发 生 明 显 的 细 胞 凋 亡；与 Sham 组 比 较，I/R 组 小鼠 肾 小 管 上 皮 细 胞 发 生 大 量 的 细 胞 凋 亡；与 I/R 组比 较，过 表 达 miR-21-3p 小 鼠 肾 小 管 上 皮 细 胞 凋 亡程 度 明 显 减 低，进 一 步 用 PIF 抑 制 p53 表 达 后 凋 亡细 胞 显 著 减 少（P 0.05），I/R+agomir 组 与 I/R+PIF 组 未 见 明 显 差 别。见 图5。表 1 引 物 序 列Tab.1Sequences of
40、 the primers名称p53miR-21-3pU6GAPDH序列Forward:5-CCATCTACAAGCAGTCACA-3 Reverse:5-CCATCTACAAGCAGTCACA-3 Forward:5 ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA-3 Reverse:5-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACAACT-3 Forward:5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3 Reverse:5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 Forward:5-TCAACGGCACAGTCAAGG-3 Reverse
41、:5-ACTCCACGACATACTCAGC-3 43210Relative RNA expression of miR213p（U6）Sham 组I/R 组I/R+agomir 组I/R+agomir+PIF 组I/R+PIF 组*2.52.01.51.00.50.0Relative RNA expression of p53（GAPDH）A BSham 组I/R 组I/R+agomir 组I/R+agomir+PIF 组I/R+PIF 组注：A，miR-21-3p 表 达；B，p53 表 达。*P 0.05图 1 缺 血 再 灌 注 肾 组 织 miR-21-3p 和 p53 的 基 因
42、表 达Fig.1mRNA expressions of miR-21-3p andp53 in I/R kidney tissues2478实 用 医 学 杂 志 2023 年 第 39 卷 第 19 期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.195mfe：-22.1 kcal/molNC mimicmiR213p mimic*86420NC mimicmiR213p mimicNC inhibitormiR213p inhibitorNC mimicNC WT MUT p532.52.01.51.00.50.0Relative lu
43、ciferase activityRelative RNA expressionof p53（GAPDH）Light field Fluorescent lightTransfection efficiencyAB C DE注：A、B，miR-21-3p 与 p53 存 在 互 补 核 苷 酸 序 列；C，双 荧 光 素 酶 报 告 实 验 WT-miR-21-3p 与 p53 共 转 染 后；D，miR-21-3p 调 控 p53 的 表达；E，miR-21-3p 的 转 染 效 率。*P 0.05图 2 miR-21-3p 靶 向 调 控 p53 表 达Fig.2miR-21-3p tar
44、geted and regulated p53 expressionI/R+agomir+PIF 组I/R+PIF 组I/R+agomir 组I/R 组Sham 组*403020100BUN（mmol/L）1.20.80.40.0Cys C（mg/L）150100500Scr（mol/L）A B CI/R+agomir+PIF 组I/R+PIF 组I/R+agomir 组I/R 组Sham 组I/R+agomir+PIF 组I/R+PIF 组I/R+agomir 组I/R 组Sham 组注：A，BUN；B，Cys C；C，Scr；*P 0.05图 3 各 组 小 鼠 血 中 Cys C、Scr
45、 和 BUN 含 量 检 测Fig.3Content of CysC，BUN and Scr in different groups2479实 用 医 学 杂 志 2023 年 第 39 卷 第 19 期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.192.6miR213p/p53 通 过 调 控 I/R 损 伤 后 肾 细 胞 凋亡 抑 制 肾 功 能 损 伤 与 Sham 组 比 较，I/R 组 肾 组织 促 凋 亡 蛋 白 p53、Bax、Caspase-3 表 达 均 升 高，抗凋 亡 蛋 白Bcl-2 表 达 均 降 低（P 0.
46、05）；与I/R 组 相 比，I/R+agomir 组、I/R+PIF、I/R+agomir+PIF 组 肾组 织 细 胞 不 同 程 度 地 降 低 了 Bax、升 高 了 Bcl-2 和降 低 了 Caspase-3 和 p53 表 达，I/R+agomir+PIF 组抑 制 凋 亡 蛋 白 表 达 水 平 更 明 显（P 0.05）；此 外，Bax/Bcl-2 比 例 下 降，从 而 减 少 了 Caspase-3 的 产 生，起 到 抑 制 细 胞 凋 亡 作 用（图 6）。3 讨 论本 课 题 采 取“增 加 外 源 性”和“消 除 内 源 性”的设 计 方 案 来 验 证 miR-
47、21-3p/p53 对 I/R 的 肾 损 伤 作用。在 体 外 实 验 中，应 用 双 荧 光 素 酶 报 告 基 因 实验 检 测 miR-21-3p 和 p53 之 间 的 反 馈 关 系；通 过 上调 或 沉 默 miR-21-3p 表 达，研 究 其 对 肾 脏 保 护 作 用的 靶 点。在 体 内 实 验 中，通 过 在 体 miRNA 干 扰 等手 段，明 确 miR-21-3p/p53 的 作 用。其 次，本 课 题 从体 外、体 内 两 个 层 次，从 分 子、细 胞 和 整 体 水 平 对miR-21-3p/p53 抗 AKI 的 作 用 与 机 制 加 以 探 讨。本研
48、究 证 明 了 I/R 导 致 AKI 的 模 型 中 的 miR-21-3p 显著 降 低，因 此 可 以 将 miR-21-3p 确 定 为 缺 血 性 AKI背 景 下 的 重 要 转 录 后 调 节 因 子。此 外，I/R 导 致AKI 中 miR-21-3p 的 低 表 达 加 重 肾 损 伤 并 参 与 炎 症反 应 增 强，上 调 miR-21-3p 可 改 善 肾 功 能，下 调 p53I/R+agomir+PIF 组I/R+PIF 组I/R+agomir 组I/R 组Sham 组*100806040200TNF（g/mL）806040200IL1（g/mL）20151050h
49、sCRP（mg/L）A B CI/R+agomir+PIF 组I/R+PIF 组I/R+agomir 组I/R 组Sham 组I/R+agomir+PIF 组I/R+PIF 组I/R+agomir 组I/R 组Sham 组注：A，TNF-；B，IL-1；C，hs-CRP。*P 0.05图 4 各 组 小 鼠 血 中 TNF-、IL-1 和 hs-CRP 含 量 检 测Fig.4 Content of TNF-，IL-1 and hs-CRP in different groupsI/R+agomir+PIF 组I/R+PIF 组I/R+agomir 组I/R 组Sham 组*504030201
50、00Apoptotic rate（%）I/R+agomir+PIF 组 I/R+PIF 组 I/R+agomir 组 I/R 组 Sham 组DAPI TUNEL MergeA B注：A，荧 光 检 测 凋 亡 率；B，凋 亡 率 结 果。*P0.05图 5 各 组 小 鼠 肾 组 织 细 胞 凋 亡 情 况 的 比 较Fig.5 Comparison of renal cell apoptosis in various groups of mice（Bar=100 m）2480实 用 医 学 杂 志 2023 年 第 39 卷 第 19 期 The Journal of Practical
