1、基 金 项 目:黑 龙 江 省 自 然 科 学 基 金 联 合 引 导 项 目(编 号:)作 者 单 位:哈 尔 滨 医 科 大 学 附 属 第 四 医 院 普 外 科(哈 尔 滨)作 者 简 介:张 岩 男()本 科 主 任 医 师 从 事 结 直 肠 癌 耐 药 机 制 的 研 究 通 信 作 者:刘 昶:.调 控 结 直 肠 癌 细 胞 对 氟 尿 嘧 啶 敏 感 性 的机 制 研 究张 岩 田 素 礼 周 勇 旭 刘 昶【摘 要】目 的 研 究()和 氟 尿 嘧 啶()联 合 对 耐 药 结 直 肠 癌(/)细 胞增 殖、凋 亡 的 影 响 探 讨 表 达 对 结 直 肠 癌 细 胞
2、敏 感 性 的 调 控 机 制 方 法 收 集 年 月 年 月 手术 切 除 的 结 直 肠 癌 组 织 和 癌 旁 组 织 培 养 结 直 肠 癌 细 胞 系(、)和 正 常 结 肠 上 皮 细 胞()培 养 细 胞 并 构 建 耐 药 结 直 肠 癌 细 胞(/)用 检 测 细 胞 和 组 织 中 的 表 达 量 对 细 胞 和/细 胞 均 瞬 时 转 染、和 分 为 组(空 载 体 组)、组(过 表 达 组)和 组(抑 制 组)以 及 与 联 合 处 理 的 组 和 组(空 细 胞 组)采 用 法 检 测 细 胞 增 殖 和 半 数 抑 制 浓 度()流 式 细 胞 术 检 测 各 组
3、细 胞 凋 亡 情况 检 测 各 组 的、和 蛋 白 表 达 变 化 结 果 结 直 肠 癌 组 织 中 的 表达 量 明 显 低 于 癌 旁 组 织(.)结 直 肠 癌 细 胞 系 中 的 表 达 量 明 显 低 于 细 胞(.)/细 胞 中 的 的 表 达 量 低 于 细 胞(.)转 染 后 组 的 表 达 量 高 于 空 载 体 组(.)抑 制 组 的 表 达 量 低 于 空 载 体 组(.)与 空 载 体 组 相 比 过 表 达 组 中 细 胞 的 增 殖 能 力 明 显 降 低 细 胞 凋 亡 率 增 加(.)而 抑 制 组 结 果 与 之 相 反(.)过 表 达 组 细 胞 中 和
4、 的 表 达 水 平 均 高 于 空 载 体 组(.)而 抑 制 组 和 的 表 达 水 平 均 低 于空 载 体 组(.)对/细 胞 的 高 于 细 胞(/./.)与 空 细 胞 组 和 过 表 达 组 相 比 组 的 细 胞 和/细 胞 增 殖活 力 均 显 著 下 降(分 别 为.)凋 亡 率增 加 组 中/细 胞 的 蛋 白 水 平 下 降(.)结论 过 表 达 可 增 加/细 胞 对 的 药 物 敏 感 性 其 机 制 可 能 与 抑 制 相 关【关 键 词】结 直 肠 癌 耐 药 氟 尿 嘧 啶【中 图 分 类 号】.【文 献 标 识 码】:./.【】()()(/).(/)./.(
5、)()().().实 用 肿 瘤 学 杂 志 年 第 卷 第 期 总 第 期(.).(.)./(.).(.)(.).(.)(.).(.)(.)./(/./.)./(.)(.)./(.)./.【】结 直 肠 癌 是 全 球 第 三 大 常 见 肿 瘤 在 恶 性 肿 瘤相 关 死 亡 率 中 排 名 第 二 目 前 用 于 结 直 肠 癌 的化 疗 组 合 主 要 以 氟 尿 嘧 啶()为 基 础 的 治 疗 方 案 然 而 结 直 肠 癌 患 者 的 年 生 存率 仍 然 较 低 发 生 耐 药 是 化 疗 失 败 和 疾 病 复 发 的 主要 原 因 之 一 因 此 阐 明 耐 药 的 分
6、子 机 制对 制 定 合 适 的 治 疗 方 案 至 关 重 要 微 小()是 一 类 大 约 由 个 核 苷 酸 组 成 的 小 非 编 码 它 通 过 识 别 区 的 位 点 调 控 表 达 水平 同 时 的 表 达 变 化 也 能 调 控 肿 瘤 细胞 对 药 物 的 敏 感 性 是 最 保 守 和 最 古 老的 之 一 位 于 号 染 色 体(.)上 已 有 的 研 究 表 明 在 肿 瘤 中 异 常 表 达 主 要作 为 肿 瘤 抑 制 因 子 通 过 靶 向 多 种 信 号 通 路 降 低 肿瘤 对 化 疗 的 耐 药 性 有 研 究 发 现 在 结 直 肠 癌中 通 过 调 节
7、西 妥 昔 单 抗 的 敏 感性 基 于 此 本 研 究 将 探 究 表 达 对 结 直肠 癌 耐 药 细 胞 株 药 物 敏 感 性 的 调 控 作 用 为 逆 转 结直 肠 癌 耐 药 提 供 新 的 理 论 依 据 材 料 与 方 法.临 床 样 本收 集 哈 尔 滨 医 科 大 学 附 属 第 四 医 院 年 月 年 月 手 术 切 除 的 例 结 直 肠 癌 组 织 及其 配 对 癌 旁 组 织 已 通 过 哈 尔 滨 医 科 大 学 的 医 学 伦理 审 批(批 号:)结 直 肠 癌 样 本 诊 断分 类 以 世 界 卫 生 组 织()结 直 肠 癌 诊 断 标 准 为标 准 样
8、本 取 下 后 立 即 放 入 液 氮 中 冷 冻 后 置 于 保 存.主 要 试 剂人 结 直 肠 癌 细 胞 系、和 购 自 中 国 科 学 院 典 型 培 养 物 保 藏 委 员 会 上海 细 胞 库 正 常 结 肠 上 皮 细 胞 购 自 美 国 细 胞 库 胎 牛 血 清 和 培 养 基 购 自 美 国 公 司、和 抗 体 购 自 美 国 公 司、和 购 自 中 国 上 海 吉 玛 制药 技 术 有 限 公 司 购 自 上 海 碧 云 天 生 物 技术 公 司 荧 光 定 量 试 剂 盒 和 反 转 录 试剂 盒 购 自 日 本 公 司 购 自 山 东 齐 鲁药 业 股 份 有 限
9、公 司 购 自 美国 赛 默 飞 公 司.方 法.细 胞 培 养 将 正 常 结 直 肠 细 胞、人结 直 肠 癌 细 胞 系、和 耐 药 细胞/培 养 于 含 有 胎 牛 血 清 及 青 霉素、链 霉 素 双 抗 的 培 养 基 中 人 结 直 肠 癌 细胞 系 细 胞 培 养 在 含 有 胎 牛 血 清 的 培 养 基 中 置 于、培 养 箱中 培 养/细 胞 在 培 养 过 程 中 加 入 终浓 度/维 持 细 胞 耐 药 性.实 时 荧 光 定 量()检 测 表 达 提 取 组 织 和 细 胞 中 总 采 用 将 提 取 的 逆 转 录 成 以 为 模 板 利 用 在()进 行 实 用
10、 肿 瘤 学 杂 志 年 第 卷 第 期 总 第 期 检 测 用.软 件 设 计 引 物 上 游 引 物 为 下 游 引 物 为 以 为 内 参 上 游 引 物:下 游 引 物 扩 增 反 应 条 件 为:预 变 性 变 性 退 火 个 循 环 延 伸 采 用 法 计 算 的 相 对 表 达 量 实 验 重 复 次.细 胞 转 染、序 列 信 息 如 表 所 示 对 数 生 长 期 和/细 胞 接 种 于 孔 板 中 密度 为 个/孔 待 细 胞 密 度 生 长 至 时 采 用 将、瞬 时 转 染 至 细 胞 中 将、转 染 至/细 胞 中/细 胞 分 为 过 表 达 组、空 载 体 组、与
11、联 合 处 理 的 组 和 空 细胞 组(未 经 任 何 处 理)细 胞 同 样 分 为 以 上 组 和 抑 制 组 置 于、体 积 分 数 为 的 培 养 箱 中 培 养 培 养 后 更 换 新 鲜 培 养 基 继 续 培养 后 用 于 细 胞 实 验 表 过 表 达 和 抑 制 的 序 列 信 息().法 检 测 细 胞 增 殖 和 对 的 敏感 性 将 和 耐 药 细 胞 株/接种 于 孔 板 中 每 孔 个 细 胞 待 细 胞 融 合至 时 加 入 不 同 浓 度(、/)的 然 后 继 续 培 养 再 加 入 继 续 孵 育 使 用 酶 标 仪 在 波 长 处 测 定 吸 光 光 度(
12、)值 计 算 两 种 细 胞 株 的 值 将 对 照 组 和 抑 制 组 的 细 胞 接 种 于 孔 板 中 继 续 培 养 每 孔 加 入 孵 育 利 用 酶 标 仪 在 波 长 测 吸 光 度()值 计 算 细 胞 增 殖 能 力.流 式 细 胞 术 检 测 细 胞 凋 亡 将 各 组 细 胞 接种 至 孔 板 中 培 养 后 弃 去 培 养 基 制 成 单 细 胞悬 液 根 据 细 胞 凋 亡 检 测 试 剂 盒 说 明 书 加 入 和 进 行 双 染 室 温 下 避 光温 育 使 用 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 凋 亡 率.法 检 测、表 达 水 平 收 集 各 组 细 胞 用
13、 进 行 裂 解 离 心 提 取 总 蛋 白 用 试 剂 盒 检 测 蛋 白浓 度 处 理 使 蛋 白 变 性 中 进 行 电 泳 分 离 蛋 白 转 至 膜 上 加 入 脱 脂 牛 奶 封 闭 接 着 加 入()、()、()、()、()一 抗 孵 育 过 夜 洗 涤三 次 加 二 抗 室 温 孵 育 洗 膜 次 发 光 显 影 软 件 分 析 条 带 灰 度 值 所 有 实 验 重 复 次.统 计 学 分 析 采 用.软 件 进 行 统计 学 分 析 计 量 资 料 用 均 数 标 准 差 表 示 两 组 成对 样 本 采 用 配 对 检 验 多 组 间 比 较 采 用 方 差 分析 进 一
14、 步 采 用 法 进 行 两 两 比 较.为差 异 有 统 计 学 意 义 结 果.结 直 肠 癌 旁 组 织 与 结 直 肠 癌 组 织 的表 达 水 平实 时 荧 光 定 量 结 果 显 示 在 成 对 的 结 肠癌 患 者 样 本 中 与 癌 旁 组 织 相 比(.)癌 组织 表 达 水 平 降 低(.)差 异 具 有 统计 学 意 义(.)(图)图 癌 旁 组 织 与 结 直 肠 癌 组 织 中 的 表 达 水 平 实 用 肿 瘤 学 杂 志 年 第 卷 第 期 总 第 期.在 结 直 肠 癌 细 胞 系 和 正 常 细 胞 系 中的 表 达 水 平 检 测 结 果 显 示 结 直 肠
15、 癌 细 胞 系、和 中 的 表达 量 分 别 为(.)、(.)、(.)和(.)均 低 于 正 常 结 肠 上 皮 细胞 系 中 的 表 达 量(.)差 异 有 统 计 学 意 义(.)本 研 究 选 择 结 直 肠癌 细 胞 进 行 后 续 的 功 能 实 验(图).转 染 和 后 细 胞 的 表 达 水 平使 用、转 染 细 胞 后 进 行 结 果 显 示 细 胞 转染 后 表 达 量(.)明 显 高 于 空 载 体 组(.)差 异 具 有 统 计 学意 义(.图)转 染 后 表 达 量(.)明 显 低 于 空 载 体 组(.)差 异 具 有 统 计 学 意 义(.图)说 明 和 转染 成
16、 功.转 染 和 后 对 细胞 增 殖 的 影 响与 空 载 体 组 相 比 转 染 后 第 天 细 胞 增 殖 水 平 开 始 明 显 降 低 差 异 具 有统 计 学 意 义(.图)而 转 染 后 第 天 细 胞 增 殖 能 力 开 始 增 强 差 异 具 有 统 计 学 意 义(.图).转 染 和 后 对 细胞 凋 亡 的 影 响流 式 细 胞 分 析 检 测 发 现 转 染 后 细 胞 凋 亡 率 明 显 增 加 差 异 具 有 统 计 学 意 义(.图)而 转 染 后 细 胞 凋 亡 率 明 显 降 低 差 异 具 有 统 计 学 意 义(.图)通 过 法 检 测 细 胞 凋 亡 相
17、 关 蛋 白、的 表 达 发 现 与 空 载 体 组 相比 转 染 后 细 胞、的 蛋 白 表 达 水 平 明 显 升 高 差 异 具有 统 计 学 意 义(.图)而 转 染 使、的 蛋 白 表 达 水 平 明 显 降 低(.)差 异 具有 统 计 学 意 义(图)图 在 结 直 肠 癌 细 胞 系 和 正 常 细 胞 系 的 表 达水 平:.图 转 染 和 后 细 胞 中 的 表 达 水 平 变 化:.实 用 肿 瘤 学 杂 志 年 第 卷 第 期 总 第 期图 转 染 和 后 对 细 胞 增 殖 的 影 响:.图 转 染 和 后 对 细 胞 凋 亡 的 影 响:.细 胞 和/细 胞 对 敏
18、 感 性 的 比 较构 建 耐 药 细 胞 株/和/以 及 细 胞 在 不 同 浓 度 作 用 后 检 测 结 果 显 示 耐 药 细 胞 株 增 殖 活 性 明显 高 于 差 异 具 有 统 计 学 意 义(.图)说 明 耐 药 株 构 建 成 功 进 一 步 利 用 检 测 结 果 显 示 细 胞 的 为./细 胞 的 为/差 异 具有 统 计 学 意 义(.图).在 和/细 胞 株 中的 表 达 比 较 检 测 在 和/细 胞 中 的 表 达 量 结 果 显 示/细 胞 中 的 表 达 量(.)明 显 低 于 细 胞(.)差 异 具 有 统 计 学 意 义(.)(图).转 染 联 合 对
19、 和/细 胞 增 殖 的 影 响 结 果 显 示 使 用 转 染 细 胞 后 组 细 胞 中 的 表 达 量 明 显 高 于 组(.)和 空 载 体 组(.)同 样 使 用 转 染/细 胞 后 组 细 胞 中 的 表 达 量 明 显 高 于 组(.)和空 载 体 组(.)说 明 两 株 细 胞 转 染 成 功(图)实 用 肿 瘤 学 杂 志 年 第 卷 第 期 总 第 期接 下 来 对 成 功 转 染 基 础 上 给与 处 理 后 的 两 株 细 胞 进 行 细 胞 活 力 检 测 检 测 结 果 显 示 空 细 胞 组、和 三 组 之 间 有 统 计 学 差 异(:./:.)进 一 步 两
20、组 间比 较 组 细 胞 活 力 低于 空 白 对 照 组 细 胞(.)/细 胞 活 力 低 于 空白 对 照 组 细 胞(.)差 异 具 有 统 计 学 意 义 说 明 在 细胞 中 转 染 后 细 胞 活 力 降 低 加 入 后降 低 更 显 著 耐 药 细 胞 同 样 如 此(图)图 在 和/细 胞 株 中 的 表达 比 较/:.图 细 胞 和/细 胞 对 敏 感 性 的 比 较/:.图 转 染 联 合 对 和/细 胞 增 殖 的 影 响/:./.实 用 肿 瘤 学 杂 志 年 第 卷 第 期 总 第 期.转 染 联 合 对 和/细 胞 凋 亡 的 影 响流 式 细 胞 术 检 测 结
21、果 显 示 在 转 染 后 进 一 步 处 理 的 组的 细 胞 凋 亡 率 明 显 高 于 组 和空 细 胞 组 差 异 有 统 计 学 意 义(.)同 样 转染 后/细 胞 的 凋 亡 率 明显 高 于 组 和 空 细 胞 组 差 异 有 统 计学 意 义(.)(图)图 转 染 联 合 对 和/细 胞 凋 亡 的 影 响/.转 染 联 合 对/细 胞 中 和 蛋 白 表 达 的 影 响转 染 联 合 处 理/细 胞 后 组、组、组 在/细 胞 中 的 表 达 水 平 分 别 为.无 统 计 学 差 异(.)组、和 组 的 表 达 水 平 分 别 为.差 异 具 有 统 计 学 意义(.)进
22、 一 步 两 组 间 比 较 组 和 组 的 均 低 于 组 蛋 白 水 平 分别 为(.)差 异 具 有 统 计 学 意 义(.图)图 转 染 联 合 对/细 胞 中 和 蛋 白 表 达 的 影 响/:./.实 用 肿 瘤 学 杂 志 年 第 卷 第 期 总 第 期 讨 论结 直 肠 癌 是 常 见 的 恶 性 消 化 道 肿 瘤 之 一 我国 结 直 肠 癌 发 病 率 和 死 亡 率 逐 年 上 升 且 呈 年 轻 化趋 势 结 直 肠 癌 的 治 疗 手 段 包 括 手 术 切 除、放 化疗 和 靶 向 药 物 治 疗 等 作 为 治 疗 结 直 肠癌 的 一 线 化 疗 药 物 但
23、其 耐 药 性 仍 是 化 疗 失 败 的 重要 原 因 已 知 的 耐 药 机 制 有 药 物 外 排 泵、细胞 周 期 阻 滞、上 皮 间 充 质 转 化()诱 导 以 及 介 导 的 表 观 遗 传 学 变 化、免 疫 系 统 抑 制等 缺 乏 蛋 白 编 码 能 力 主 要 在 转 录 后 水 平对 靶 基 因 的 表 达 进 行 调 控 后 从 而 调 节 结 直 肠 癌 细胞 的 增 殖、凋 亡、血 管 生 成 以 及 对 的 化 疗 敏感 性 有 研 究 表 明 在 结 直 肠 癌 中 主要 作 为 抑 癌 基 因 调 控 结 直 肠 癌 发 生 发 展 本实 验 验 证 了 在
24、 结 直 肠 癌 细 胞 和 组 织 中 下调 通 过 转 染 和 来 使 结 直 肠癌 细 胞 中 发 生 过 表 达 和 抑 制 研 究 结 果 显示 的 过 表 达 可 以 抑 制 细 胞 增 殖 促进 凋 亡 而 抑 制 后 结 果 相 反 说 明 发 挥 抑 癌 基 因 作 用 影 响 结 直 肠 癌 细 胞 的 增 殖 和 凋亡 因 此 当 过 表 达 时 可 以 抑 制 结 直 肠 癌细 胞 增 殖 促 进 结 直 肠 癌 细 胞 凋 亡 同 时 发 现 在/细 胞 中 的 表 达 水 平 低 于 细 胞 说 明 在 结 直 肠 癌 细 胞 化 疗 耐药 中 起 一 定 作 用
25、当 过 表 达 同 时 用 处 理 后 和/细 胞 活 力 明 显 降低 细 胞 凋 亡 明 显 增 加 说 明 过 表 达 联 合 可 以 增 加 结 直 肠 癌 细 胞 对 的 敏 感 性 等 研 究 发 现 靶 向 可 以 增加 胃 癌 细 胞 对 顺 铂 的 敏 感 性 说 明 在 肿 瘤耐 药 性 中 起 着 关 键 作 用 是 一 种 非 典 型 丝氨 酸/苏 氨 酸 蛋 白 激 酶 能 够 介 导 结 直 肠 癌 细 胞 对 的 耐 药 性 研 究 表 明 连 翘 能 够 下 调 信号 通 路 的 表 达 逆 转 结 直 肠 癌 细 胞 对 的 耐 药 白 藜 芦 醇 降 低 细
26、 胞 内 水 平 从 而 抑 制 结 直 肠 癌 细 胞 的 增 殖 说 明 表 达 水 平 影 响 结 直 肠 癌 细 胞 增 殖 以 及 对 耐 药 本 研 究 中 在/细 胞 中 转 染 以 及 在 转 染 基 础 上 进一 步 用 处 理 后 蛋 白 表 达 均 降 低 说 明 过 表 达 能 够 降 低 水 平 增 加结 直 肠 癌 细 胞 对 的 敏 感 性 综 上 所 述 本 研 究 发 现 在 结 直 肠 癌 组织 中 低 表 达 并 对 其 进 行 了 初 步 探 索 能够 抑 制 结 直 肠 癌 细 胞 的 增 殖 促 进 细 胞 凋 亡 增 强结 直 肠 癌 细 胞 对
27、的 敏 感 性 其 作 用 机 制 可 能与 抑 制 水 平 有 关 值 得 研 究 者 们 在 未 来进 行 更 多 的 探 索 参 考 文 献.:.():.():.:.():.:.:.():.:.:.()():.():.刘 宗 超 李 哲 轩 张 阳 等.全 球 癌 症 统 计 报 告 解 读.肿 瘤 综 合 治 疗 电 子 杂 志():.:.():.:.():.:.实 用 肿 瘤 学 杂 志 年 第 卷 第 期 总 第 期 吕 春 歌 曹 秋 影 杨 萍.通 过 下 调 表 达 在 结 直 肠 癌 中 所 起 的 促 癌 作 用 研 究.胃 肠病 学 和 肝 病 学 杂 志():.():
28、.():.俞 燕 丽 傅 睿.连 翘 提 取 物 通 过 信号 通 路 逆 转 结 肠 癌 氟 尿 嘧 啶 耐 药 细 胞 株 的 研 究.新中 医():.肖 忠 盛 龙 泓 丁 成 明 等.白 藜 芦 醇 通 过 调 控 信号 通 路 抑 制 结 直 肠 癌 细 胞 的 增 殖 和 糖 酵 解 作 用.实用 医 学 杂 志():.(收 稿 日 期:修 回 日 期:)肿 瘤 快 讯 多 国 超 万 人 数 据 每 多 做 一 次 患 这 种 癌 症 的 风 险 高 上 的 最 新 研 究 表 示 从 多 国 队 列 中 收 集 来 的 接 受 检 查()的超 万 名 参 与 者(岁)数 据 显
29、 示 剂 量 的 累 积 与 所 有 的 血 液 恶 性 肿 瘤 风 险 之 间 存 在正 向 关 联 即 每 增 加 的 辐 射 剂 量 罹 患 全 血 液 恶 性 肿 瘤 的 风 险 升 高 类 似 的 情况 也 发 生 在 淋 巴 和 骨 髓 恶 性 肿 瘤 中 但 即 使 在 低 剂 量()的 情 况 下 依 然 会 增 加非 霍 奇 金 淋 巴 瘤 和 成 熟 细 胞 肿 瘤 的 风 险 因 此 在 检 查“盛 行”的 今 天 更 应 该 警 惕 低 剂 量 下 检 查 可 能 带 来 的 癌 症 风 险 强调 了 优 化 剂 量 的 必 要 性(摘 自:子 刊)实 用 肿 瘤 学 杂 志 年 第 卷 第 期 总 第 期
