1、全 科 医 学 临 床 与 教 育 2023 年 9 月 第 21 卷 第 9 期 Clinical Education of General Practice Sep.2023，Vol.21，No.9DOI：10.13558/ki.iss n1672-3686.2023.009.005作者单位：310007 浙江杭州，杭州市中医院急诊科 论 著 miR-22-3 p 靶 向 调 控 PLAGL 2 保 护 OGD/R 诱 导 的心 肌 细 胞 损 伤 机 制 研 究陈玥璇 汪潞 柳华锋 摘 要 目 的 探 讨 miR-22-3 p 在 氧-糖 剥 夺/复 氧（OGD/R）心 肌 细 胞 铁
2、死 亡 中 的 作 用 及 机 制。方 法 大 鼠 心 肌 细胞 系 H 9 c 2 采 用 OGD/R 处 理 以 及 转 染 miR-22-3 p 模 拟 物（miR-22-3 p mimic）。细 胞 根 据 是 否 缺 氧及有无转染 分为常氧 组、OGD/R 组、OGD/R+miRNA 模 拟 物 阴 性 对 照（miRNA-NC 组）和 OGD/R+miR-22-3 p 组。采 用 细 胞 计 数（CCK-8）法 检 测 细 胞 活 力，酶 联 免 疫 吸 附 测 定（ELISA）试 剂 盒 检 测 H 9 c 2 细 胞 中 铁 死 亡 指 标 水 平，We stern blot
3、检 测 谷 胱 甘 肽 过氧 化 物 酶 4（Gpx 4）及 多 形 性 腺 瘤 基 因 样 蛋 白 2（PLAGL 2）蛋 白 表 达，双 荧 光 素 酶 报 告 实 验 验 证 miR-22-3 p 和PLA GL 2 靶 向 关 系。结 果 OGD/R 处 理 H 9 c 2 细 胞 后，第 4 天 的 吸 光 度 值 低 于 常 氧 组，活 性 氧（ROS）及 丙 二 醛（MDA）水 平、Fe2+的 积 累 明 显 高 于 常 氧 组，miR-22-3 p 水 平 明 显 低 于 常 氧 组（t 分 别=3.78、4.24、2.54、4.47、3.53，P 均 0.05），H 9 c
4、2 细 胞 转 染 miR-22-3 p mimic 及 OGD/R 处 理 后，第 3、4 天 的 吸 光 度 值 高 于 miR-NC+OGD/R 组（t 分 别=2.98、1.97、2.57、2.46，P 均 0.05），细 胞 MDA、ROS、Fe2+明 显 低 于 OGD/R+miR-NC 组（t 分 别=2.62、5.35、4.11，P 均 0.05），Gpx 4 表 达 水 平 高 于 OGD/R+miR-NC 组。Fer-1 和 OGD/R 处 理 H 9 c 2 细 胞 后，第 3、4 天 的 细 胞 吸 光 度 值 明 显 高于 OGD/R 组（t 分 别=3.12、3.3
5、6，P 均 0.05），细 胞 MDA、ROS 和 Fe2+水 平 显 著 低 于 OGD/R 组（t 分 别=3.03、5.33、2.48，P 均 0.05）。H 9 c 2 细 胞 转 染 miR-22-3 p 组 的 PLAGL 2 蛋 白 表 达 明 显 低 于 miR-NC 组，且 PLAGL 2-WT+miR-22-3 p组 的 荧 光 素 酶 活 性 明 显 低 于 PLAGL 2-MUT+miR-22-3 p 组（t=2.69，P 0.05）。H 9 c 2 细 胞 共 转 染 miR-22-3 p mimic和 PLAGL 2 过 表 达 质 粒 后，Gpx 4 表 达 低
6、于 OGD/R+miR-22-3 p 组，吸 光 度 值 明 显 低 于 OGD/R+miR-22-3 p 组（t 分 别=3.91、3.12，P 均 0.05），MDA、Fe2+、ROS 水 平 高 于 OGD/R+miR-22-3 p 组（t 分 别=3.78、3.87、3.05，P 均 0.05）。结论 miR-22-3 p 靶 向 调 控 PLAGL 2 表 达 抑 制 铁 死 亡，进 而 降 低 OGD/R 诱 导 的 心 肌 细 胞 损 伤。关 键 词 miR-22-3 p；PLAGL 2；OGD/R；心 肌 细 胞；铁 死 亡Study on mechanism of miR-2
7、2-3 p protection against OGD/R-induced cardiomyocyte injury by targetingPLA GL 2 CHEN Yuexuan，WANG Lu，LIU Huafeng.Department of Emergency，Hangzhou Traditional Chinese MedicineHospital，Hangzhou 310007，China.Abstract Objective To study the role of miR-22-3 p in oxygen and glucose deprivation/reoxygena
8、tion（OGD/R）in duced myocardial cell injury and the mechanism.Methods Rat myocardial cell line H 9 c 2 was cultured upon OGD/Rand transfetced with miR-22-3 p mimic.Based on the presence or absence of hypoxia and transfection，cells were dividedinto normal oxygen group，OGD/R group，OGD/R+miRNA-NC group，
9、and OGD/R+miR-22-3 p mimic group.Cell viabilityand ferroptosis markers were detected by CCK-8 and ELISA methods.The expression of Gpx 4 and PLAGL 2 proteins weredetected by western blot.Dual luciferase reporting assay verified the targeting relationship between miR-22-3 p and PLA GL 2.Results After
10、OGD/R treatment，the absorbance value of H 9 c 2 cells on 4 th day was lower than that of the normaloxygen group，the accumulation of ROS，MDA and Fe2+was significantly higher than that of the normal oxygen group，thelevel of miR-22-3 p was significantly lower than that of the normal oxygen group（t=3.78
11、，4.24，2.54，4.47，3.53，P 0.05）.After transfected with miR-22-3 p mimic and subjected to OGD/R in H 9 c 2 cells，the absorbance was higher thanthat of miR-NC+OGD/R group at third and fourth day（t=2.98，1.97，2.57，2.46，P 0.05）.MDA，ROS and Fe2+were sig nificantly lower than those in OGD/R+miR-NC group（t=2.6
12、2，5.35，4.11，P 0.05），and Gpx 4 expression level was high er than that in OGD/R+miR-NC group.After Fer-1and OGD/R treatment，the absorbance of H 9 c 2 cellsat third and fourth day was significantly higher than 784全 科 医 学 临 床 与 教 育 2023 年 9 月 第 21 卷 第 9 期 Clinical Education of General Practice Sep.2023，
13、Vol.21，No.9that of OGD/R group（t=3.12，3.36，P 0.05）.The levels of MDA，ROS and Fe2+were significantly lower than those ofOGD/R group（t=3.03，5.33，2.48，P 0.05）.The PLAGL 2 protein expression in H 9 c 2 cells transfected with miR-22-3 pgroup was significantly lower than that of miR-NC group.The luciferas
14、e activity in PLAGL 2-WT+miR-22-3 p group wassignificantly lower than that of PLAGL 2-MUT+miR-22-3 p group（t=2.69，P 0.05）.After co-transfected with miR-22-3 p mimic and PLAGL 2 overexpression plasmid，the Gpx 4 expression in H 9 c 2 cells was lower than that of OGD/R+miR-22-3 p group，and the absorban
15、ce was significantly lower than that of OGD/R+miR-22-3 p group（t=3.91，3.12，P 0.05）.The levels of MDA，Fe2+and ROS were higher than those of OGD/R+miR-22-3 p group（t=3.78，3.87，3.05，P 0.05）.Conclusion miR-22-3 p inhibits ferroptosis and reduces OGD/R-induced myocardial cell injury via targeting PLAGL 2
16、.Key words miR-22-3 p；PLAGL 2；OGD/R；cardiomyocytes；ferroptosis心 肌 缺 血 再 灌 注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤 是 指 急 性 冠 状 动 脉 闭 塞 后，再 灌 注 导 致 更 严 重的 心 肌 损 伤，是 影 响 心 肌 梗 死 患 者 预 后 的 重 要 因素 1。铁 死 亡 是 一 种 新 型 的 调 节 性 细 胞 死 亡，其 特征 是 铁 依 赖 的 脂 质 过 氧 化 物 累 积，在 心 肌 缺 血 等多 种 疾 病 中 发 挥 重 要 作 用 2。微 小 RNA（microR NAs
17、，miRNAs）在 转 录 后 水 平 调 控 基 因 表 达，参与 调 控 细 胞 增 殖、分 化、凋 亡 和 自 噬 等 过 程。有 研究 表 明 miR-22-3 p 可 作 为 诊 断 冠 心 病 的 特 异 性 生物 标 志 物 3，然 而 miR-22-3 p 在 I/R 损 伤 期 间 对 于心 肌 细 胞 损 伤 的 保 护 机 制 尚 不 清 楚。因 此，本 次研 究 探 讨 了 I/R 过 程 中 miR-22-3 p 对 心 肌 细 胞 保护 的 分 子 机 制。1 材料与方法1.1 研 究 对 象 本 次 研 究 起 止 时 间 为 2022 年 8 月至 2023 年
18、 4 月，采 用 购 自 武 汉 普 诺 赛 生 命 科 技 有 限公 司 的 大 鼠 心 肌 细 胞 系 H 9 c 2 作 为 研 究 对 象。所 有实验操作均在杭州市中医院实验室进行。1.2 细 胞 培 养 和 转 染 H 9 c 2 细 胞 在 含 10 胎 牛 血清、100 U/ml 青 霉 素 和 100 g/ml 链 霉 素 的 DMEM 培养 液 中，置 于 37 含 5 CO 2 的 恒 温 细 胞 培 养 箱 中培 养。转 染 方 法 参 考 LipofectamineTM2 000 转 染 说 明书，转染 48 h 后收集细胞用于后续实验。1.3 氧 糖 剥 夺/复 氧（
19、oxygen and glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）体 外 细 胞 模 型 构 建 H 9 c 2细 胞 根 据 是 否 缺 氧 分 为 常 氧 组、OGD/R 组，根 据 是否 转 染 miR-22-3 p mimic 分 为 OGD/R 组+miR-NC组，OGD/R+miR-22-3 p 组，根 据 是 否 共 转 染 miR-22-3 p mimic 和 Fer-1 分 为 OGD/R+Fer-1 组 和 OGD/R-Fer-1+miR-22-3 p 组，根 据 是 否 共 转 染 miR-22-3 p mimic 和 PLAGL 2
20、过 表 达 质 粒 分 为 OGD/R+miR-22-3 p 组 和 OGD/R+miR-22-3 p+PLAGL 2 组。OGD/R 处 理 方 法 如 下：H 9 c 2 细 胞 在 血 清 和 无 糖 DMEM 中培 养，含 有 1 O 2、5 CO 2 和 94 N 2，37 下 培 养 6 h。缺 氧 后，细 胞 在 正 常 生 长 条 件 下（5 CO 2 和 95 空气）的 完 全 培 养 基 中 再 培 养 12 h。常 氧 组 细 胞 在 正常 生 长 条 件 下，用 完 全 DMEM 培 养 液 培 养。本 次 实 验为 验 证 miR-22-3 p 对 铁 死 亡 的 调
21、 控，H 9 c 2 细 胞 用60 nmol/L 铁 死 亡 抑 制 剂 Fer-1 进 行 预 处 理 24 h，然 后 用 OGD（6 h）/R（12 h）处理。1.4 CCK-8 检 测 细 胞 活 力 将 H 9 c 2 细 胞 以 1 104细胞/孔 的 密 度 接 种 到 96 孔 板 中。OGD/R 处 理 18 h后，根 据 说 明 书 要 求，使 用 CCK-8 试 剂 盒 检 测 分 别在 24 h、48 h、72 h 和 96 h 的 细 胞 活 力。每 孔 加 入10 l CCK-8 溶 液，在 37 孵 育 3 h 后，用 酶 标 仪 测定 450 nm 处的吸光度
22、。1.5 实 时 定 量 PCR（quantitative real-time poly merase chain reaction，qRT-PCR）用 Nanodrop 检 测从 H 9 c 2 细 胞 中 分 离 的 RNA 浓 度 和 纯 度。逆 转 录 体系 为 1 l oligo（dT）Primer，用 ddH 2 O 补 充 至 10 l，逆 转 录 程 序 为 37，15 min，85，5 s。qRT-PCR反 应 体 系，12.5 l SYBR Premix Ex Taq，1 lcDNA 和 上 下 游 引 物 各 0.5 l，ddH 2 O 补 充 至 25 l。采 用 2-
23、Ct公 式 计 算 miR-22-3 p 相 对 表 达 量，U 6 作为 内 参。引 物 如 下 所 示：miR-22-3 p：5-AAGCUGCCGUUGAAGAACUGU-3（正 向），5-GT GCAGGGTCCGAGGT-3（反 向）；U 6：5-AACCT TATATCGGGCGGGA-3（正 向），5-TTACGGCGAT GCATAAT-3（反向）。1.6 铁 死 亡 水 平 测 定 取 细 胞 悬 液，用 磷 酸 缓 冲 盐溶 液（phosphate buffer saline，PBS）洗 涤 细 胞 1 2 次。通 过 反 复 冻 融，使 细 胞 破 坏 并 放 出 细 胞
24、 内 成份。4，2 500 r/min 离 心 20 min，弃 沉 淀、取 上清。根 据 试 剂 盒 说 明 书，测 定 细 胞 内 活 性 氧（reac tive oxygen species，ROS）、丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）、Fe2+水平。785全 科 医 学 临 床 与 教 育 2023 年 9 月 第 21 卷 第 9 期 Clinical Education of General Practice Sep.2023，Vol.21，No.91.7 双 荧 光 素 酶 报 告 基 因 实 验 借 助 Tar getScan 7.1（http：/www.ta
25、rgetscan.org/vert_ 71/）网 站用 于 预 测 miR-22-3 p 与 PLAGL 2 的 靶 向 结 合 位 点。含 有 预 测 miR-22-3 p 结 合 位 点 的 报 告 载 体pmiRGLO-PLAGL 2 野 生 型 质 粒（PLAGL 2-WT）或miRGLO-PLAGL 2 突 变 型 质 粒（PLAGL 2-MUT）。使用 Lipofectamine 2 000 进 行 mi R-22-3 p mimic 与PLAGL 2 质 粒 共 转 染，并 分 为 PLAGL 2-WT+mirR-22-3 p 组 和 PLAGL 2-MUT-mirR-22-3
26、p 组。48 h 后，用双萤光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶活性。1.8 Western blot 检 测 Gpx 4 蛋 白 使 用 BCA 试 剂 盒测 定 蛋 白 浓 度，再 用 10 SDA-PAGE 进 行 电 泳，转移 至 PVDF 膜 上。室 温 下 使 用 5 脱 脂 牛 奶 封 闭 2 h后，PVDF 膜 与 一 抗 PLAGL 2（1 1000）、Gpx 4（1 1000）或-actin（1 10000）4 过 夜 孵 育。TBST 洗膜，使 用 兔 二 抗（1 5000）孵 育 1 h。TBST 洗 膜，使 用ECL 试剂检测蛋白信号。1.9 统 计 学 方 法 采 用
27、 SPSS 19.0 统 计 学 软 件 进 行数 据 分 析。计 量 资 料 以 均 数 标 准 差（x s）表 示。组间 计量 资料 比较 采用 t 检验；计数 资料 比较 采用 2检验。设 P 0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 OGD/R 诱 导 H 9 c 2 细 胞 后 不 同 时 间 的 吸 光 度 值比较见表 1表 1 OGD/R 诱导 H 9 c 2 细胞后不同时间的吸光度值比较组别OGD/R 组常氧组第 1 天0.17 0.040.18 0.03第 2 天0.20 0.130.28 0.25第 3 天0.31 0.270.55 0.42第 4 天0.42 0.34
28、*0.78 0.38注：*：与常氧组比较，P 0.05。由 表 1 可 见，OGD/R 组 H 9 c 2 细 胞 在 第 1 天、第2 天 和 第 3 天 的 吸 光 度 值 与 常 氧 组 比 较，差 异 均 无统 计 学 意 义（t 分 别=0.21、0.86、0.25，P 均 0.05），OGD/R 组 H 9 c 2 细 胞 在 第 4 天 的 吸 光 度 值 低 于 常 氧组，差异有统计学意义（t=3.78，P 0.05）。2.2 OGD/R 诱 导 H 9 c 2 细 胞 后 ROS、MDA、Fe2+及miR-22-3 p 水平比较见表 2表 2 OGD/R 诱导 H 9 c 2
29、 细胞后 ROS、MDA、Fe2+及 miR-22-3 p水平比较组别OGD/R 组常氧组ROS/ng/L380.45 5.64*55.56 2.15MDA/nmol/L3.22 0.76*0.26 0.20Fe2+/nmol/L20.56 4.35*4.95 1.02miR-22-3 p0.15 0.02*0.57 0.13注：*：与常氧组比较，P 0.05。由 表 2 可 见，OGD/R 组 H 9 c 2 细 胞 ROS 及 MDA水 平、Fe2+的 积 累 明 显 高 于 常 氧 组，miR-22-3 p 水 平明 显 低 于 常 氧 组，差 异 均 有 统 计 学 意 义（t 分 别
30、=4.24、2.54、4.47、3.53，P 均0.05）。2.3 Western blot 检 测 OGD/R 诱 导 H 9 c 2 细 胞 后Gpx 4 蛋白水平见图 1Gpx 4GAPDH常氧组 OGD/R 组图 1 Western blot 检测 OGD/R 诱导 H 9 c 2 细胞后Gpx 4 蛋白水平由 图 1 可 见，Western blot 实 验 进 一 步 证 实，Gpx 4 蛋白表达在 OGD/R 组明显降低。2.4 H 9 c 2 细 胞 中 miR-22-3 p mimic 转 染 效 率 miR-22-3 p 组 的 miR-22-3 p 表 达 水 平（3.5
31、6 0.43），明 显高 于 OGD/R+miR-NC 组（0.23 0.14），差 异 有 统 计 学意义（t=3.25，P 0.05）。2.5 H 9 c 2 细 胞 OGD/R 处 理 及 转 染 miR-22-3 pmi mic 后吸光度值比较见表 3表 3 H 9 c 2 细胞 OGD/R 处理及转染 miR-22-3 p mimic 后吸光度值比较组别常氧组OGD/R 组OGD/R+miR-NC 组OGD/R+miR-22-3 p 组第 1 天0.13 0.020.14 0.010.15 0.020.14 0.03第 2 天0.29 0.150.22 0.100.20 0.130.
32、21 0.15第 3 天0.59 0.220.32 0.25*0.33 0.200.45 0.16#第 4 天0.82 0.280.43 0.24*0.44 0.210.66 0.19#注：*：与 常 氧 组 比 较，P 0.05；#：与 OGD/R+miR-NC 组 比 较，P 0.05。由 表 3 可 见，各 组 在 第 1 天 和 第 2 天 间 吸 光 度值 比 较，差 异 均 无 统 计 学 意 义（F 分 别=0.88、0.22，P均 0.05），第 3 天 和 第 4 天，OGD/R 组 吸 光 度 值 高于 常 氧 组，OGD/R+miR-22-3 p 组 吸 光 度 值 高
33、于OGD/R+miR-NC 组，差 异 均 有 统 计 学 意 义（t 分 别=2.98、1.97、2.57、2.46，P 均0.05）。2.6 H 9 c 2 细 胞 中 转 染 miR-22-3 p mimic 后 ROS、MDA、Fe2+水平比较见表 4由 表 4 可 见，OGD/R 组 H 9 c 2 细 胞 中 MDA、ROS水 平、Fe2+的 积 累 明 显 高 于 常 氧 组，差 异 均 有 统 计 学意 义（t 分 别=3.33、2.47、2.03，P 均 0.05），而 OGD/R+miR-22-3 p 组 MDA、ROS 水 平、Fe2+的 积 累 明 显 低 于 786全
34、 科 医 学 临 床 与 教 育 2023 年 9 月 第 21 卷 第 9 期 Clinical Education of General Practice Sep.2023，Vol.21，No.9注：A 为 Targetscan 预测 PLAGL 2 和 miR-22-3 p 的特异性结合位点；B 为 Western blot 检测 PLAGL 2 蛋白表达水平。图 3 miR-22-3 p 对 PLAGL 2 的表达调控检测PLAGL 2GAPDHmiR-NC 组 miR-22-3 p 组 常氧组ABOGD/R+miR-NC 组，差 异 均 有 统 计 学 意 义（t 分 别=2.62、
35、5.35、4.11，P 均0.05）。表 4 H 9 c 2 细胞中转染 miR-22-3 p mimic 后 ROS、MDA、Fe2+水平比较组别常氧组OGD/R 组OGD/R+miR-NC 组OGD/R+miR-22-3 p 组ROS/ng/L58.35 2.15390.45 8.24*386.58 14.18166.38 11.64#MDA/nmol/L0.31 0.163.14 0.42*2.84 0.801.24 0.15#Fe2+/nmol/L2.45 0.1720.63 5.14*17.27 4.528.35 4.31#注：*：与 常 氧 组 比 较，P 0.05；#：与 OGD
36、/R+miR-NC 组 比 较，P 0.05。2.7 H 9 c 2 细 胞 中 转 染 miR-22-3 p mimic 后 Gpx 4 表达水平比较见图 2Gpx 4GAPDH常氧组OGD/R 组OGD/R+miR-NC 组OGD/R+miR-22-3 p 组图 2 Western blot 检测 H 9 c 2 细胞中 Gpx 4 蛋白表达由 图 2 可 见，OGD/R 组 Gpx 4 表 达 水 平 下 调，而OGD/R+miR-22-3 p 组 Gpx 4 表 达 水 平 显 著 上 调。2.8 OGD/R 后 细 胞 转 染 miR-22-3 p mimic 和 Fer-1处理后吸
37、光度值比较见表 5由 表 5 可 见，第 1 天 和 第 2 天，各 组 间 吸 光 度 值比 较，差 异 均 无 统 计 学 意 义（F 分 别=0.04、0.32，P 均 0.05）。第 3 天 和 第 4 天，OGD/R 组 吸 光 度 值 低 于 常氧 组（t 分 别=4.66、3.21，P 均 0.05），OGD/R+Fer-1 组吸 光 度 值 明 显 高 于 OGD/R 组（t 分 别=3.12、3.36，P 均0.05）。而 OGD/R+Fer-1+miR-22-3 p 组 吸 光 度值 与 OGD/R+Fer-1 组 比 较，差 异 均 无 统 计 学 意 义（t分别=0.3
38、1、1.06，P 均 0.05）。表 5 OGD/R 后细胞转染 miR-22-3 p mimic 和 Fer-1 处理后吸光度值比较组别常氧组OGD/R 组OGD/R+Fer-1 组OGD/R+Fer-1+miR-22-3 p 组第 1 天0.22 0.020.20 0.050.21 0.040.21 0.03第 2 天0.35 0.050.25 0.100.23 0.030.22 0.12第 3 天0.62 0.170.42 0.19*0.59 0.12#0.55 0.14第 4 天0.88 0.180.53 0.23*0.80 0.17#0.71 0.23注：*：与 常 氧 组 比 较，
39、P 0.05；#：与 OGD/R+miR-NC 组 比 较，P 0.05。2.9 OGD/R 后 细 胞 转 染 miR-22-3 p mimic 和 Fer-1处理后 ROS、MDA、Fe2+水平比较见表 6表 6 OGD/R 后细胞转染 miR-22-3 p mimic 和 Fer-1 处理后ROS、MDA、Fe2+水平检测组别常氧组OGD/R 组OGD/R+Fer-1 组OGD/R+Fer-1+miR-22-3 p 组ROS/ng/L61.30 6.03394.60 10.12*171.35 8.14#180.43 9.55MDA/nmol/L0.22 0.062.93 0.12*1.1
40、7 0.43#1.19 0.25Fe2+/nmol/L2.25 0.3118.26 4.53*5.57 1.02#6.05 1.31注：*：与 常 氧 组 比 较，P 0.05；#：与 OGD/R+miR-NC 组 比 较，P 0.05。由 表 6 可 见，OGD/R 组 H 9 c 2 细 胞 MDA 及 ROS水 平、Fe2+的 积 累 明 显 高 于 常 氧 组，差 异 均 有 统 计 学意 义（t 分 别=4.52、3.49、3.39，P 均 0.05），GD/R+Fer-1 组 逆 转 下 调 MDA、ROS 和 Fe2+水 平（t 分 别=3.03、5.33、2.48，P 均 0.
41、05）。OGD/R+Fer-1+miR-22-3 p 组 H 9 c 2 细 胞 MDA 及 ROS 水 平、Fe2+的 积 累 与OGD/R+Fer-1 组 比 较，差 异 均 无 统 计 学 意 义（t 分 别=0.21、1.18、0.63，P 均0.05）。2.10 mi R-22-3 p 对 PLAGL 2 的 表 达 调 控 检 测 见图 3 787全 科 医 学 临 床 与 教 育 2023 年 9 月 第 21 卷 第 9 期 Clinical Education of General Practice Sep.2023，Vol.21，No.9由 图 3 A 可 见，通 过 Ta
42、rgetscan 靶 向 关 系 预 测 网站 发 现 miR-22-3 p 和 PLAGL 2 存 在 特 异 性 结 合 位点。由 图 3 B 可 见，H 9 c 2 细 胞 转 染 miR-22-3 p 组 的PLAGL 2 蛋白表达明显低于 miR-NC 组。2.11 miR-22-3 p 靶 向 调 控 PLAGL 2 表 达 的 检 测PLAGL 2-WT+miR-22-3 p 组 的 荧 光 素 酶 活 性 为（0.95 0.15），明 显 低 于 PLAGL 2-MUT+miR-22-3 p组（0.24 0.05），差 异 有 统 计 学 意 义（t=2.69，P 0.05）。
43、2.12 过表达 PLAGL 2 对 Gpx 4 的表达调控见图 4由 图 4 A、4 B 可 见，共 转 染 miR-22-3 p mimic 和PLAGL 2 过 表 达 质 粒 组 细 胞 中 PLAGL 2 表 达 显 著 高于 miR-22-3 p 转 染 组，Gpx 4 表 达 显 著 低 于 miR-22-3 p 转染组。PLAGL 2GAPDH常氧组 miR-22-3 p 组miR-22-3 p+PLAGL 2 组Gpx 4GAPDH常氧组 OGD/R 组OGD/R+miR-22-3 p 组OGD/R+miR-22-3 p+PLAGL 2 组AB图 4 Western blot
44、 检测 H 9 c 2 细胞 PLAGL 2 和Gpx 4 蛋白表达水平2.13 OGD/R 后 细 胞 共 转 染 miR-22-3 p mimic 和PLAGL 2 过表达质粒后吸光度值见表 7表 7 OGD/R 后细胞共转染 miR-22-3 p mimic 和 PLAGL 2 过表达质粒后吸光度值组别常氧组OGD/R 组OGD/R+miR-22-3 p 组OGD/R+miR-22-3 p+PLAGL 2 组第 1 天0.18 0.030.18 0.040.17 0.030.19 0.02第 2 天0.37 0.040.32 0.090.35 0.070.34 0.11第 3 天0.61
45、 0.090.32 0.07*0.57 0.11#0.41 0.12第 4 天0.84 0.130.41 0.10*0.78 0.15#0.46 0.15注：*：与常氧组比较，P 0.05；#：与 OGD/R 组比较，P 0.05；：与 OGD/R+miR-22-3 p 组比较，P 0.05。由 表 7 可 见，第 1、2 天，各 组 细 胞 吸 光 度 值 比较，差 异 均 无 统 计 学 意 义（F 分 别=0.21、0.12，P 均 0.05）。第 3、4 天，OGD/R 组 吸 光 度 值 明 显 高 于 常 氧组，差 异 均 有 统 计 学 意 义（t 分 别=6.33、7.18，P
46、 均 0.05）。OGD/R+miR-22-3 p 组 吸 光 度 值 明 显 高 于OGD/R 组（t 分 别=3.11、4.22，P 均 0.05），OGD/R+miR-22-3 p+PLAGL 2 组 的 吸 光 度 值 明 显 低 于OGD/R+miR-22-3 p 组，差 异 均 有 统 计 学 意 义（t 分别=3.91、3.12，P 均0.05）。2.14 OGD/R 后 细 胞 共 转 染 miR-22-3 p mimic 和PLAGL 2 过 表 达 质 粒 后 ROS、MDA、Fe2+水 平 比 较 见表 8表 8 OGD/R 后细胞共转染 miR-22-3 p mimic
47、 和 PLAGL 2 过表达质粒后 ROS、MDA、Fe2+水平组别常氧组OGD/R 组OGD/R+miR-22-3 p 组OGD/R+miR-22-3 p+PLAGL 2 组ROS/ng/L56.35 4.24383.50 7.32*156.63 8.05#356.46 8.58MDA/nmol/L0.26 0.162.91 0.10*1.21 0.31#2.79 0.20Fe2+/nmol/L2.13 0.4618.18 3.58*5.17 1.32#14.85 1.25注：*：与常氧组比较，P 0.05；#：与 OGD/R 组比较，P 0.05；：与 OGD/R+miR-22-3 p 组
48、比较，P 0.05。由 表 8 可 见，OGD/R 组 ROS、MDA、Fe2+水 平 明 显高 于 常 氧 组（t 分 别=4.52、3.54、4.01，P 均 0.05），OGD/R+miR-22-3 p 组 MDA 及 Fe2+、ROS 水 平 明 显低 于 OGD/R 组（t 分 别=4.71、4.35、3.05，P 均 0.05）。OGD/R+miR-22-3 p+PLAGL 2 组 的 MDA 及 Fe2+、ROS水 平 高 于 OGD/R+miR-22-3 p（t 分 别=3.74、3.87、3.05，P 均 0.05）。3 讨论最 近 的 研 究 表 明，I/R 损 伤 会 导
49、 致 miRNAs 的 表达 改 变，影 响 心 肌 细 胞 的 存 活 和 恢 复。此 外，仍 有其 它 研 究 指 出 miR-22-3 p 在 冠 状 动 脉 疾 病 过 程 中起 作 用，可 作 为 诊 断 冠 状 动 脉 疾 病 的 特 异 性 标 志物 3。本 次 研 究 揭 示 miR-22-3 p 在 体 外 心 肌 细 胞OGD/R 损 伤 过 程 起 到 保 护 作 用，其 机 制 为 通 过 靶 向 788全 科 医 学 临 床 与 教 育 2023 年 9 月 第 21 卷 第 9 期 Clinical Education of General Practice Sep
50、.2023，Vol.21，No.9PLAGL 2 蛋白表达抑制铁死亡。既 往 研 究 已 证 实 铁 死 亡 在 心 肌 病、心 肌 梗 死、缺 血 再 灌 注 损 伤 等 疾 病 中 发 挥 重 要 作 用 4。miRNAs如 miR-7-5 p、miR-150-5 p 和 miR-706 等 通 过 调 控心 肌 细 胞 铁 死 亡，参 与 心 脏 发 育、心 肌 重 塑 和 心 力衰 竭 等 生 物 过 程。本 次 研 究 发 现 OGD/R 诱 导 心 肌细 胞 损 伤 过 程 中 伴 随 铁 死 亡 指 标 MDA 及 Fe2+、ROS水 平 上 调，miR-22-3 p 表 达 水
