1、植物组织离体培养-概念和基础理 论(1)摘要：植物组织培养技术是现代生物技术的重要部分，已 经 广泛地应用于农林业、工 业、医药业等，对社会的经济发展作出了 贡献，更 应认识到其深入发 展的潜能。就当前而言，植物 组织培养技术的应用至少包括；植物组织离体快繁、通 过原生 质体融合和体细胞变异等方法创造新品种、次生代谢物的生产 、种 质资源保存以及用于研究揭示植物的生理生化 规律等等，植物组织离体快繁则是被利用最广泛最有成效的方面，可以 认为是现代农业、工厂化 农业中最具进步性显示其价值的方面，因此系 统地理解其基本理 论和疏理当前的研究成果和发展很有必要。植物组织离体培养将分几个部分 陆续发表
2、，供同行参考评论。关键词： 植物 组织培养、发展简史、植物组织培养的类型、植物组织培养的特点、植物组培养体系的建立、植物细胞的全能性与植物的再生性、愈 伤组织 、根芽激素理论、遗传稳定性。植物组织培养（Plant Tissue Culture；In Vitro Culture）是现代生物技术的重要部分，是利用植物体离体的器官（如根、茎、叶、花、果实等）组织（如分生组织、表皮组织、薄壁组织等）或细胞（如大孢子、小 孢子、体 细胞等）以及原生质 体，在无菌和适宜的人工培养基及适宜的光照、温度、气体等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的新兴学科和技术，同 时， 组织培养
3、的组培苗是一项 能获得大量同源母本基因幼苗的生物技术, 又称植物克隆育苗技术。 植物组织培养是生物技术在农业上应用较成熟、 较广泛，产业化程度也较高。我国植物组织培养产业化始于20世纪70年代， 从马铃薯去病毒、建立马铃薯无病毒薯基地开始，80年代的葡萄、草莓、苹果、甘蔗、香蕉、大蒜等的成功应用和产业化，90年代后期的芦 荟 和洋兰使我国的试管苗产业 得到了极大的发展，已形成了规模生产能力的新兴产业植 物 组 培 业亦称植 物 微 繁 业 。1.植 物 组 织 培 养 的 概 念 、类 型 与 特 点1.1.植 物 组 织 培 养 的 概 念植 物 组 织 培 养 （plant Tissue
4、culture）是 指 用 无 菌 方 法 使 植 物 体 的 离 体 器 官 、组织 和 细 胞 在 人 为 提 供 的 条 件 下 生 长 和 发 育 的 所 有 培 养 技 术 的 总 称 。一 般 而 言 就 是 利 用植 物 体 的 器 官 、组 织 或 细 胞 ，通 过 无 菌 操 作 接 种 于 人 工 配 制 的 培 养 基 上 ，在 一 定 的 光 照 、温 度 和 通 气 等 条 件 下 进 行 培 养 ，使 之 生 长 发 育 的 技 术 称 为 植 物 组 织 培 养 ，狭 义 而 言 就 是对 植 物 的 组 织 （如 分 生 组 织 、表 皮 组 织 、薄 壁 组
5、织 等 ）及 培 养 产 生 的 愈 伤 组 织 （callus）实 行 离 体 培 养 的 技 术 体 系 ，因 培 养 的 植 物 材 料 已 离 开 母 体 ，也 称 之 为 离 体 培 养 （In vitro culture）。它 的 理 论 基 础 就 是 植 物 细 胞 全 能 性 的 理 论 （cell Totipotency），指 植 物 有 核 细 胞 能 够 发 展 成 为 一 棵 完 整 植 株 的 潜 能 ，就 是 说 正 常 生 物 体 的 每 一 个 细 胞 ，都 含 有 该 物 种 的 全 部 遗 传 信 息 ，在 一 定 的 条 件 下 都 具 有 发 育 成
6、一 株 完 整 个 体 的 潜 在 能力 。组 织 培 养 的 理 论 、实 践 、技 术 和 方 法 不 断 完 善 和 发 展 ，已 形 成 独 具 特 色 的 专 业 技 术 ；在 实 验 技 术 上 建 立 了 较 完 整 的 实 验 程 序 ，已 成 为 一 种 重 要 和 精 细 的 实 验 技 术 ；组 织 培 养已 广 泛 应 用 于 生 物 学 的 许 多 分 支 学 科 ，并 取 得 丰 硕 的 成 果 ；在 农 业 领 域 乃 至 其 它 领 域 的应 用 并 达 到 商 业 化 水 平 ，更 显 示 出 这 项 技 术 的 先 导 性 、实 用 性 和 经 济 价 值
7、。1. 植物组织培养发展简史组织培养技术的蓬勃发展是应用科学理论到技术开发实践的成功范例，它的发展一般认为可以分为五个阶段：探索阶段（1902-1929年）：20世纪初， 在德国植物学家.schleiden 和动物学家.Schwann提出细胞学说，该学说基本内容是：一切生物都是 细胞构成的， 细 胞是生物体的基本功能单位，细胞只能由细胞分裂而来。1902年德国植物学家 Haberlandt 提出了高等植物的器官和组织为许多细胞组成的观点，以及植物细胞全能性的理 论，即植物的体 细胞， 在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的潜在能力。 他首次发表了植物离体细胞培养实验的报告。191
8、2年， Haberlandt的学生 Kotte 和美国的 Robins 在根尖培养中获得了组织培养的成功。Kotte 采用了无机盐、葡萄糖、蛋白胨、天冬酰胺，及添加各种氨基酸的培养基。Robins 用含无机盐、加葡萄糖或果糖的琼脂培养基，培养了长度为1.45-3.75厘米的豌豆、玉米和棉花的茎尖，形成了一些缺绿的茎和根。组培方法和定义的建立阶段（1930-1939年）：自 Haberlandt的实验之后，直到1934年美国学者 White 由番茄根建立了第一个活 跃生长的无性繁殖系， 并反复转移到新鲜培养基中继代培养，使根的离体培养实验获得了真正的成功，并在以后 28年间培养了 1600代。
9、这之后，White 又以小麦根尖为材料， 研究了光、温度、通气、 pH、培养基 组成等各种培养条件 对生长的影响，并于1937年建立了第一个组织培养的综合培养基， 其成份均为已知化合物，包括3种 B 族维生素，即吡哆醇、硫胺素和烟酸，该培养基后来被定名 为 White 培养基。与此同 时，法国学者 Gautheret(1934)在研究山毛柳和黑杨等形成层的组织培养实验中，提出了 B 族维生素和生长素对组织培养的重要意义，并于1939年连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。 同年，White 由烟草种间杂种的瘤组织，法国学者 Nobecourt 由胡萝卜均建立了与上述 类似的连续生长的组织 培养物
10、。因此Gautheret，White 和 Nobecourt 一起被誉为组织培养学科的奠基人。 我们现在所用的培养方法和培养基，基本上都是由这三位科学家建立的。后来，White 于1943年发表了植物组织培养手册专著，使植物组织培养开始成为 一门新兴的学科。细胞全能性、根芽激素理论 的证实阶段（1940-1959）：四十年代 Skoog 和崔 瀓（南开大学教授、著名植物生理学家），在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中发现，腺 嘌呤或腺苷可以解除培养基中生长素(IAA)对芽形成的抑制作用，而能诱导形成芽，从而明确了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。 即这一比例高时，产生芽；
11、这一比例低 时， 则形成根， 相等则不分化。在寻找促进细胞分裂的物质过程中， Miller 等人于1956年发现了激动素。 激动素（kinetin,KT,带有呋喃环的腺嘌呤）可以代替腺嘌呤促进发芽，并且效果可增加几万倍。从而使控制器官发生（reganogenesis）的激素模式变为激动素与生长素的比例关系。 这方面的成功发现，有力地推动了植物组织培养的发展，为植物 组织培养中完整植株的再生（regeneration）建立了理论基础。1952年，morel 和 Martin 通过茎尖分生组织的离体培养，从已受病毒侵染的大 丽花中首次获得无病毒植株。19351945年 Muir 把单细胞放在一张铺
12、在愈伤组织上面的滤纸上培养，使细胞发生了分裂，即实施了看护接种技术，使单细 胞培养获得初步成功。组培技术和理论迅速发展阶段（1960-1979）：1960年，cocking 等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。1971 年， Takebe 等在烟草上首次由原生质 体获得了再生植株， 这不仅在理论上证明了无壁的原生质体同样具有全能性，而且在 实践上为外源基因的 导入提供了理想的受体材料。80年代中期以来，对禾谷类作物的原生质体培养也相继告捷，在这方面中国学者作出了重要贡献。组培技术在生产上广泛应用阶段（1980-今）：1962年印度德里大学 Guha 等人成功地在毛叶曼陀罗花药培养中，由
13、花粉诱导得到 单倍体植株， 这促进了花药和花粉培养的研究。以后相继在烟草、水稻、小麦、玉米、番茄、辣椒、草莓、苹果等多种植物获得成功，其数目达到160多种，其中烟草、水稻和小麦等的花药育种培养在中国取得了引人注目的成就。1960年， Morel 提出了一个离体无性繁殖兰花的方法，其繁殖系数极高。由于这一方法有很大的应用价值， 很快被兰花生产者所采用，迅速建立起兰花工业。 1973年 Carlson 等通过 两个烟草物种之间原生质体融合，获得了第一个体细胞杂种，Cocking 等倡导的原生质体培养和体细胞杂交，研究得到了迅速发展， 已经能使矮牵牛和烟草属的杂种细胞增殖分化生成杂种植株。在整个组织
14、培养发 展的历程中， 我国学者做出多方面的贡献，除了前述的崔 瀓的工作以外，还有李继侗（著名植 物 生 理 学 家 ，曾 任 南 开 、北 大 、清 华 教 授 后 任 内 蒙 古 大 学 副 校 长 ），等关于玉米等植物离体根尖培养的工作，以及罗士韦（著名植 物 生 理 学 家 。曾 任 北 京 大 学 教 授 、中 国 科 学 院 实 验 生 物 研 究 所 、植 物 生 理 研 究 所 研 究 员 ）关于幼胚和茎尖培养， 李正理（北 京大 学 教 授 、著 名 植 物 形 态 解 剖 学 家 ）关于离体胚培养、 王伏雄 （中 国 科 学 院 植 物 研 究 所 研 究员 。著 名 植 物
15、 胚 胎 学 和 花 粉 形 态 学 家 ）等关于幼胚培养的工作。组织培养在现代生物技术中具有重要的地位，不断丰富生物学科的基 础理论，它的 应用是多方面的，主要是快速繁殖种苗 (rapid propagation)；无病毒苗(Virus free)的培养；在育种上的应用(breeding )如用花药培养单倍体植株、用原生质体进行体细胞杂交、转基因植物的快繁、用子房、胚和胚珠完成胚的试管发育和试管受精等 、用于突变体的筛选；人工种子；种质资源离体保存；工厂化育苗(industrilizing propagation)如兰花产业 、其它花卉产业；用器官和细胞组培产生次生代谢物直接生产生物产品等。
16、上述这些方面的应用还在广泛深入，科研极为活跃 成果不断涌现，并表 现出多学科交叉的特征，具有巨大的可预期的发展潜力。器官离体快繁，是当前植物组织 培养中最实用、最广泛、发展最快并最具产业化规模和经济效益的部分，同时也是开展植物 组织培养其它方面研 发工作的重要基础。离体快繁的特点是植物组织培养特点的一部分，尤其表 现为繁殖系数大、周年生产、繁殖速快、苗木整 齐一致等，应用这项技术可以使一个植株或一个 组织一年生 产出几万到几百万甚至上千万株苗，是传统常规育苗所无法比 拟的。目前 试管苗在国际市场 上已产业化，我国进入产业化比较成熟的有：香蕉、甘蔗、桉树 、葡萄、苹果、脱毒马铃薯、脱毒草莓、脱毒
17、柑橘苗、花卉、部分中草药、芦荟等等。1.3.植物组织培养的类型(The type of plant tissue culture)植物组织培养的类型一般都按外植体来源和培养对象分类，可分为（1），器官培养(organ culture)。指植物某一器官的全部或部分或器官原基的离体培养,包括根（根尖）,茎（茎尖、茎段、直立茎、攀援茎、缠绕茎、匍匐茎、 取其带有节和腋芽或节间的茎段；块状茎、鳞状茎、根状茎、球茎、切取其 带或不带芽眼、不定芽的均可） ,叶（包括叶原基,叶柄,叶鞘,叶片,子叶等叶组织）,花,果实,种子等；（2），组织培养（tissue culture）。对植物的各种组织进行离体培养的方
18、法。常用的如分生组织（meristem）、形成层组织（cambium）、薄壁组织（parenchyma）、 韧皮部（phloem）组织 等；（3），胚胎培养( embryo culture)。对植物成熟或未成熟胚及胚器官的离体培养，常用的有幼胚（immature embryo）、成熟胚（ mature embryo）、胚乳（endosperm）、胚珠（ovule ）、子房（ovary）等； （4）， 细胞培养 (cell culture )是对离体来源体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养，常用的有性细胞、叶肉细胞、根尖细胞、韧皮部细胞等；（5），原生质体培养(protoplast cult
19、ure ) 植物原生质体是被去掉细胞壁的由质膜包裹的、具有生活力的裸细胞，对具有生活力的裸细胞培养 就是原生质体的培养。根据快繁的增值方式或途径可以分类为：器官型，如以茎尖培养时， 调整细胞分裂素的浓度，使腋芽萌发继而形成丛 生苗，芽增芽的方式是快繁的主要方法；器官发生型（organogenesis type），通过脱分化形成愈伤组织再分化而成再生植株；胚状体发生型（embryoid type），体 细胞的增殖发育顺序类似受精卵，经过原胚球形胚心形胚鱼雷胚子叶胚个时期，故称类胚途径，最后发育成完整植株。体细胞既可以是成熟的植物根、茎、叶、花等组织细胞，亦可来自花 药壁及未成熟幼穗等。这已从伞形
20、科、禾本科等四十余科植物中观察到。胚状体可从愈 伤组织形成，亦可不 经脱分化直接从子叶、下胚轴和花药培养形成；原球茎型（protocomb type），在 兰花的茎尖或侧芽培养中发现有白色桑葚状的园球形突起，切为小块会长 出绿色莲座叶状的原球茎，再切割可建立为一个无性繁殖系，经激素调控可完成完整植株， 这是兰花快繁的主要方法；还 有球茎芽型、 块茎型、鳞茎型等。 也有根据培养方式可分为：固体培养、液体培养。固体培养法是最常用的方法；根据培养物量的多少，可称大量培养、微量培养；根据培养过程中是否需光，可称光培养、暗培养；根据培养方法的不同，可称 平板培养、微室培养、悬浮培养等；按培养过程可称初代
21、培养和继代培养。初代培养（Primary culture）：指外植体的最初培养。继代培养（Subculture）是将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这种反复多次移植的培养，称为继代培养。1.4. 植物 组织培养的特点(The characteristics of plant tissue culture)（1），培养条件可以人为控制组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的 变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一， 对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生 产。 （），生长周期短，繁殖率高植物组织培养是由于人为控制培养条件
22、，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较 快。另外，植株也比较小，往往2030d 为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何 级数繁殖生产，故 总体来说成本低廉，且能及时提供 规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。 （），管理方便，利于工厂化生产和自动化控制植物组织培养是在一定的场所和环境下，人 为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约 化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、 浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以大大 节省人力、物力
23、及田 间种植所需要的土地。（），使用材料经济、保证遗传背景一致组培材料仅使用植物体的小块组织、茎、根、叶、花、子叶、下胚轴等，这就保证了材料的生物学来源单一和遗传背景一致，有利于 组培的成功，而且所需材料仅几 mm 甚至不到mm，获取十分方便。由于取材少、获取方便、培养效果好速度快，在实际应用中有独特的价值。（），降低运输成本将植物材料以组培形式保存在培养容器内运输，开展国 际间 或地区间的种质交换，能 够节省时间，节省空间，降低运输成本，尤其能减少因从田间采集种子或其无性繁殖材料携带有害生物的危险性。1.5. 植物组培养体系的建立（The establishment of plant cul
24、ture system）建立稳定高效安全的植物组织培养体系是离体培养成功的保证，尤其在规模化快繁时更为重要。植物组织培养体系建立主要是：生物学条件系 统 ，这是植物组织培养体系中的主干系统：选取取材母株、外植体 选取及灭菌处理、启 动生长 （初代培养）、扩繁增殖（继代培养）、壮苗驯化等；化学环境条件系统：培养基的筛选及优化、 和渗透压等；物理环境条件系统：植物组织培养中温度、光照和湿度等； 这些系统组合成一个 环环相扣的组织培养体系，化学环境条件和物理环境条件两个系统则是保证主干系统正常高效运转的必要条件，从而完成从外植体到合格商品产出（包括次生代谢产物在内）全部程序。这个体系是否高效的检验标
25、准就是产出的苗商品性高、符合 标准（国际标准、国 标准、地方标准、行业标准）、低耗低排、低成本、高效益。1.5.1.生物学条件系统 植物组织培养体系的主干系统选取取材母株、外植体选 取及灭菌处理、启 动生长（初代培养）直到 继代扩，就是建立一个外植体无菌系，与其后的移栽驯化形成了完整的植物组织 培养体系的主干系统。 （1）母株选择（selection of stock plant）： 取材母株应选择该种植物中最优良品种，尤其要求选择纯度高、优质、高产、抗病毒耐病毒、抗虫、抗逆和形态美的母株，在大田或野外选取母株时应特别注意：该区域内的病虫害种类和状况，尤其要注意有无病毒病的症状及其它异常情况，
26、要在晴天，最好是中午或下午取材料，不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。尽量做到对该区域的历史 调查。取 样后除去不用的部分，必需进行严格的清洗消毒灭菌程序。母株最好来自预先在控制条件下 实验室培养的健壮无病毒 单株。无菌 发芽的材料也是取材的对象。（2）外植体选择（selection of explant）： 选择原则之一是再生能力强。不同器官或 组织再生能力差异很大，已分化的体细胞的再生过程要经历 脱分化和再分化，分化程度越高的细胞脱分化越难，所以一般情况下 应取年幼组织，茎尖和嫩梢（带芽茎段）是常用的材料 ，幼嫩的材料在生理年龄上青，因此 应在生长旺盛期取材；原则 之二是 遗传稳定性好。组
27、培的基本要求是再生植株必需保持原物种的优良性状，因此 应选变 异少的材料；原则之三是外植体来源丰富。一个优化体系的建立往往要 进行多次多项目试验 ，实验要有可重复性，所以外植体应丰富易得；原则之四是外植体灭菌容易。 应尽量选取带杂 菌少的组织，地上部比地下部灭菌容易，一年生组织比多年生 组织灭菌容易，年幼 组织比年老 组织灭菌容易；原则之五是供组培的外植体大小应适当。茎段一般 长度在 0.5-1.0cm 或面积 0.5mm2或重量达到 5-10mg 以上，太小所带的叶原基太少影响分生组织发育同 时影响成活率。如果以脱毒 为目标的，分生组织不小于 0.3mm，芽不小于 0.7mm。表 1-1 选
28、择 外植体时需要考虑的一些因素及说明。 考虑的因素 说 明外植体的年 龄一般情况外植体的年龄越小，分化的程度越小，组培的成功率就越高，因此，尽量选择幼嫩的植物组织 或器官作为外植体外植体的大小外植体很小和很大都不合适，很小的外植体极容易死亡，很大的外植体不容易消毒，因此，要选择 大小适中的外植体。例如，如果用菊花的芽进行组培，选取的芽可为3mm 左右外植体所在的部位一般选择植物的芽尖、根尖或幼嫩的茎作为外植体， 这些部位的 组织分裂能力强，容易形成愈伤组织外植体的外观形态由于外植体的消毒工作非常重要，因此，要选择哪些表面相对光滑容易消毒的外植体较好在选取外植体时还需注意一些特殊情况，如有的材料
29、易 发生褐变现象，它的 产生可能原因是：由于受胁迫条件如受伤等影响所造成的；另一种是材料伤口处分泌出的酚类化合物引起的，前者在愈伤组织适应了 胁迫环境就不再发生褐变，而后者很难清除，严重影响外植体的诱导分化，可以用调整取材 时间及一些措施以降低或减 轻褐变现象。大部分易褐 变的材料褐变发生也有一定规律可循，从 11 月份到次年 2 月份进入休眠状态时褐变率很低，随着进入生长旺盛季节，褐变率逐渐 上升， 58 月份达到最高峰，9 月份后褐变率逐渐下降直到不再发生，因此，对易褐变的外植体应在 11 月到 2 月取材，由于处休眠状态，要进行打破休眠处理，一般情况下经 的冷处理一段时间，再经培养箱内水
30、培出芽后取幼嫩部分，或将待接种材料放入温室内，保持半木质化，可 获得较理想的培养材料，另外亦可采用抗氧化剂 VC、 -生育酚 、聚乙烯吡咯 酮等在接种前浸泡，黑暗或弱光下启动生长等措施。因此要根据外植体的不同情况采取不同措施，最好先做小样试验优 化方案，就可大大提高成功率，减少投资损失。（3）常用外植体： 幼嫩茎尖、新梢节间部、新生的叶片叶柄，鳞片尤其在球根性的植物中常用，其它：种子、根、块茎、 块根、花、花粉等。（4）外植体灭菌： 植物组织培养体系是在无菌条件下确立的，无菌和防止污染的意识必需牢固地建立，而外植体灭菌 则是进入组织培养的首道关口，无菌外植体的获得是组织培养成功的前提，取自田间
31、或温室的材料毫无例外都 带有大量的 细菌和霉菌，都必需 进行仔细的适当的适度的彻底的灭菌，实 践证明最有效的是化学灭菌。灭菌后的外植体应以个瓶接种在基本培养基中预培养 天，以检验灭菌方法和程序有效。表 1=2 植物组织培养中常用灭菌剂 灭菌剂 使用浓度() 清除的难易 消毒时间（min） 效果次氯酸钠 2 易 5-30 很好次氯酸钙 9-10 易 5-30 很好氯化汞 0.1-1 较难 5-8 最好抗菌素 4-50mg/L 中 30-60 较好漂白粉 饱和浓度 易 5-30 很好过氧化氢 10-12 最易 5-15 好溴 水 1-2 易 2-10 很好酒精 70-75 易 0.2-2 好硝酸银
32、 1 较难 5-30 好外植体消毒灭菌的步骤是：材料前处理（自来水冲洗 1左右、去污、整形、再反复用自来水冲洗数次、剪切成组培适入大小放入准 备消毒的烧杯） 配制消毒剂，同时开启超净工作台用 70酒精消毒之并待机 30min。将 次氯酸钠、 氯化汞等 消毒剂从冰箱取出，在超净工作台内配制成所需浓度和数量。 烧杯、培养皿、镊子、解剖刀、滤纸、玻棒、无菌水等一切器具均要经高压灭菌。在配制成的消毒 剂中加数滴（浓度小于 0.1）的表面活性剂如吐温（tween）20 或吐温（tween）80 等以充分浸润整个组织，同时准备好 70酒精。 材料灭菌，经前处理的材料投入 70酒精表面消毒 1-2 秒钟，取
33、出投入次氯酸钠或其它消毒剂中灭菌，到时后即滤干消毒剂 ，用无菌水冲洗 次，材料放入无菌培养皿中待用，并及时接种在已配制好经灭菌处理、并 经预培养完全无菌的培养基上，送入培养室进入培养程序。外植体消毒灭菌是在超净工作台完成的。外植体的 灭菌是植物 组培快繁中的重要环节，它由原培养材料、灭菌剂、灭菌方法等因素决定，快速、高效的 灭菌方法，减少 污染瓶的丢弃，对于降低成本具有重要的意义。除上述 灭菌程序必需严格遵守外，应强调以下注意事项：方法对 成功率的影响。大量的试验证明， 0.1的升汞是最理想的 杀菌剂，但灭菌时间要求极为严格。时间过短，杀菌不彻底，时间过长，会对组织细胞有杀伤作用，不利于外植体
34、诱导分化。同时，不同的清洗方式对外植体的杀伤率和成活率影响极大，通过搅动和少量多次冲洗能够加大对升汞残留的冲洗，减少 对材料的杀伤 作用，降低褐化率，提高成功率。外植体的幼嫩程度、灭菌条件对其成活率的影响。外植体的幼嫩程度不同，其含菌量也不同，所需的灭菌条件也有差异。用酒精浓度、0.1%升汞灭菌时间两个方面进行试验，结果表明：幼嫩的外植体材料（如幼叶、幼芽、幼茎段）幼嫩的材料比老材料带菌量少，不仅所需0.1%的升汞的灭菌时间短，在7-9分钟之间能达到灭菌效果，而且酒精可用50% 来代替70%，酒精浓度的降低，可以减少对材料的伤害，不降低其粘着效能，有利于升汞的杀菌作用，提高外植体的成活率。老的
35、材料（如半木质化、木质化的茎段）茎段内生菌较多，皮部粗糙，所需0.1%升汞灭菌的时间就长（在9-12分钟之间），且必需用70% 的酒精，才能起到较好的灭菌效果。根据不同接种材料，采用不同的措施，就会减少不必要的失败和投资经费，提高成功率外植体所 带菌的种类、数量与材料种 类和取材季节 有关。有 试验表明，当年 11 月份到次年 4 月份取材最好，46 月、与 911 月份取材则较好，6 9 月份较差，这与外植体所带菌的种类、数量及灭菌难 易有关。如外植体的 污染以细 菌为主则灭菌成功率高, 如月季、樱桃、杨树等；以真菌为主则成功率低，如冬枣、花椒、茶 树等；一品红由于本身分泌白色乳状物，灭菌较
36、困难成功率亦较 低。灭菌后的外植体应以个瓶接种在基本 培养基中预培养 天，以检验灭菌方法和程序有效，然后可按相同的方法和程序进入批量外植体的 灭菌。（5）启动生长（初代培养）： 对于具体培养对象适合那种类型启动生长， 须经过摸索试验，有经验的实验室或规模经营的组培企业都有适合于自身实际水平的启动生长模型。腋芽刺激后生长出的不定芽或茎尖、叶片、花萼、子叶等其它器官外植体切面产生不定芽是通常使用方式，外植体切割面形成愈 伤组织也是一种方式。 在培养中由外植体 产生不定芽，通常首先要经脱分化过程，形成愈 伤组织的细胞，然后，经再分化，即由这些分生组织形成器官原基，它在构成器官的纵轴上表 现出单向的极
37、性，多数情况下它先形成芽，后形成根。 有些植物具有从各个器官上长出不定芽的能力如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。当在试管培养的条件下，培养基中提供了营养，特别是提供了连续不断植物激素的供 应，使植物形成不定芽的能力被大大地激发出来。许多种 类的外植体表面几乎全部 为不定芽所覆盖。在 许多常规方法中不能无性繁殖的种类，在试 管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科，松科，银杏等一些植物。许多单子叶植物 储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。在不定芽培养 时，也常用 诱导或分化培养基。用靠培养不定芽得到的培养物，一般采用芽丛进行繁殖，如非洲菊、草莓等。外植体启动生长的培养
38、基种类以及其中的细胞分裂素和生长素的种类、适宜浓度的组合最重要，不同对象是不同的，没有通用的培养基，需要优化筛选。Ms 是使用最广泛的基本培养基。通常细胞分裂素和生 长素这两类物质如果浓度相同，则有利于诱导愈伤组织；刺激腋芽生长时细胞分裂素一般适宜浓度为0.5-1.0 mg/L，生长素水平则很低，一般为0.01-0.1mg/L，诱导外植体形成不定芽时，需要 细胞分裂素类浓度水平较高，生 长素类物质的浓度较低，因为茎尖或芽等幼嫩 组织中缺少内源细胞分裂素，需要外源以促其生长发育，但不配合适浓度的生长素，接种的外植体如茎段易老化，生成的芽无主茎，相反无细胞分裂素而光用生长素，老化也不分化。启动生长
39、需要4-6周时间 ，然后进入增殖阶段。然而有些植物外植体启动生长较难时间较长，这就必须转移到新鲜的原 培养基中， 1次1月，继续诱导启动。 表1=3 组培中常用的植物生长调节剂的类型及作用 调节剂 名称 浓度范围 作用生长素类2，4二氯苯氧乙酸（2，4D）、萘 乙酸（NAA ）、吲哚丁酸（IBA ）等0.015mg/L促进细胞的伸长和分裂，促进愈伤组织和根的形成细胞分裂素类激动素（KT ）、6苄基腺嘌呤（BA 或6 BA ）、玉米素（ZT）等0.510mg/L促进细胞的横向生长和分裂，促进芽的分化和形成（6）增殖快繁（继代培养）： 通常采用以芽增芽方式，就是腋芽刺激后生长出的芽或茎尖、叶片、花
40、萼、子叶等其它器官外植体切面产生不定芽（注：不定芽是是随机发生于植物茎或叶上的结构，它是除了顶芽和腋芽以外的 组织器官上通过启 动生长新形成的芽），分割后 转移到新培养基中培养，每周继代一次。一个芽苗增殖产生的小苗可以有5-25个或更多，可进行多次继代增殖。继代次数的能力不同培养 对象是不同的，不可能无限继代，继代次数太多可能出现的问题是外源激素的大量积累，从而 产生畸形芽、玻璃芽、不能生长、茎尖褐化、进入休眠甚至失去再生潜能。降低培养基中生长激素水平可以 缓解，最好重新取材启 动生长。增殖快繁培养基配制也应通过小试优选，通常与启 动生 长培养基相当，其中的 细胞分裂素和矿物元素要高些。（7）
41、芽苗生根：当芽苗增殖到一定数量后，就要使部分芽苗及时转到生根培养阶段，它可分为诱导、生根、伸长三个阶段，从而形成新植株。 芽苗生根都是单本转接的。诱导生根方法：试管外生根法。将芽苗基部浸入0.1-10mg/LNAA 或 IBA 溶液快速浸蘸，然后植入培养基质中，喷雾保持高湿度，几天后可生根；试管内生根法。用1/2-1/4MS 培养基，撤除细胞分裂素提高生长素水平，培养1-2 天然后移至无生长素的培养基中辅于黑暗或弱光条件，效果很好。 另外，延长在增殖培养基中的培养时间、有意降低一些增殖倍率，减少细胞分裂素的用量 (即将增殖与生根合并为一步) ，亦可以诱导生根。总的原则就是：去细胞分裂素，增生长
42、素，减无机盐用量。在此阶段应注意选择强壮的苗用于驯化，淘汰劣 质、畸形、有病症状和明显不正常的芽苗。（ 8） 移栽驯化：驯化试管苗移栽是 组织培养过程的重要环节重点是选择合适的基质，并配合以相应的管理措施，才能确保整个 组织培养工作的顺 利完成。 试管苗由于是在无菌、有营养供给、适宜光照和温度和近 100%的相对湿度环境条件下生长的，因此，在生理、形态等方面都与自然条件生长的正常小苗有着很大的差异。所以必 须通过炼苗，例如通 过控水、减肥、增光、降温等措施，使它们逐渐地适应外界环境。移栽用基质和容器。基质。适合于栽种试管苗的基 质要具备透气性、保湿性和一定的肥力、容易 灭菌处理、并不利于杂菌滋
43、生、不易分解、支撑性好的特点，一般可选用泥炭、珍珠岩、蛭石、砂子等。为了增加粘着力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土等。配时需按比例搭配，一般用珍珠岩，蛭石，草炭土或腐殖土比例为 1:1:0.5。也可用砂子：草炭土或腐殖土为 1:1。要根据不同植物的栽培习性来进行配制，这样 才能获得满意的效果。几种常见的试管苗栽培基质是：河砂。河砂分为粗砂、细砂两种类型。粗砂即平常所说的河砂，其颗粒直径为 12mm。细砂即通常所说的面砂，其颗粒直径为 0.10.2mm。河砂排水性强，一般不单独使用；泥炭。泥炭是由沉积在沼泽中的植物残骸经过长时间的腐烂所形成，保水性好，蓄肥力强，呈中性或微酸性反应，宜与河砂等混合
44、后使用；腐殖土。:腐殖土是由植物落叶 经腐烂所形成。一种是自然形成，一种是人为造成，人工制造时可将秋季的落叶收集起来，然后埋人坑中，灌水压实令其腐烂。第二年春季将其取出置于空气中，在经常喷水保湿的条件下使其充分发酵熟化方可使用，腐殖土富含矿质营养、有机物质，搭配使用有助于植株发根。表 1-4 混合基质配制 混合基质配制（） 混合基质配制（）材料名称 用量 材料名称 用量 细砂 0.5m3 园艺用珍珠岩 0.5m3 草炭（经粉碎） 0.5m3 草炭（经粉碎） 0.5m3 硝酸钾 145g硫酸钾 145g 复合肥 3.00kg白云石或石灰石 4.5kg 白云石或石灰石 3.00kg钙石灰石 1.5
45、kg20过磷酸钙 1.5kg 20过磷酸钙 1.2kg容器。要根据组培材料和目的 选择合适容器， 钵、盘和苗床都可根据需要选用。移栽前的练苗。移栽前可将试管苗不开口移到自然光照下 锻炼 23d，让试管苗接受强光的照射，使其长得壮实起来，然后再开口练苗 12d，经受自然湿度的锻炼，从而完成了从不开瓶锻炼开瓶锻炼降湿增光锻炼的炼苗过程，可转入移栽驯化了。移栽 驯化。移栽驯化操作过程中注意重点是防伤苗、保湿、防病、适合的光照温度。首先，从试管中取出生根的小苗，用自来水清洗根部粘着的培养基，以防残留培养基滋生杂菌，清洗时防止伤根。栽植时用一个筷子粗的竹 签在己配制基 质中插一小孔，然后将小苗插入，幼苗
46、极幼嫩，防止伤苗。栽后把苗周围基质压实，栽前基质要浇透水。栽后轻浇薄水。再将苗移入高湿度的环境中，在移栽后 5-7d 内，空气相对湿度要求 90%以上，保 证小苗的水分供需平衡，尽量接近培养瓶的水平，让小苗始终保持挺拔的状态。具体操作时先将培养基质要浇透水，所放置的床面也要浇 湿，然后搭 设小拱棚，以减少水分的蒸发，并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄膜上有水珠出现。当 57d 后， 发现小苗有 长趋势，可逐 渐降低湿度，减少喷水次数，将拱棚两端打开通 风，使小苗适 应湿度较小的条件。约 15d 以后揭去拱棚的薄膜，并给予水分控制，逐渐减少浇水，促进小苗长得粗壮；其次是防止菌类滋生。培养基质先行灭
47、菌消毒，高压灭菌、5福尔马林喷洒后密封 5-7d 后打开至无气味使用等都有效。在 给幼苗喷雾加湿时，用多菌灵或托布津或百菌清 7l0d 一次，可以有效地保护幼苗。要强调在移苗时防止伤苗，伤致病来，造成死苗。喷雾加湿时同时加入 0.1%的尿素，或用 1/2MS大量元素的水溶液作追肥，可加快苗的生长与成活；第三是一定的温、光条件。 试管苗移栽以后要保持一定的温光条件，适宜的生根温度是 1820，温度过低幼苗生长迟缓，或不易成活。温度过高幼苗水分蒸发 太快，水分失衡，并会促使菌 类滋生。光照管理的初期应用较弱的光照，加盖遮阳网，当幼苗有了新的生长时，逐渐加强光照，后期可直接利用自然光照。促进光合产物
48、的积累，增强抗性，促其成活；最后是保持基质适当的通气性。除选择适当的基质配制外，不要浇水过多，以利根系呼吸。试管苗在移栽驯化过程中，只要把水分平衡、适宜的介质、控制杂菌和适宜的光、温条件控制好，试管苗是很容易移栽驯化的。在规模化生产的驯化过渡培养温室内，配置 调温、 调湿、调光、通气设施，驯化过渡组培苗的成活率可有更大保证。待苗长到符合标准时驯 化完成，成 为商品苗可供生 产使用了。1.5.2. 物理环境条件系统 植物组织培养中温度、光能生 长照和湿度等各种物理因素 组合成组培合宜的环境条件系统：温度。 一般情况下培养室（区）和接种室温度 应控制在 的范围，这对大多数培养对象都是适当的。低于
49、15时植物组织会表现生长停止，高于 35时对植物生长不利。高温季节要增加降温能力，培养室尤其要注意空间温度、培养架内温度的均衡。其它区 间如洗涤室（区）制备室（区）等用常温。 应注意植物原产地的温度适性，生长在高纬度寒冷地区与低纬度热带亚热带地区的植物，它 们对最适环境温度的要求是有差异的，要据此予以调整，如马铃薯要求在 下培养效果好，而菠萝则在 下培养效果好，月季是 2527，番茄是 28等；温度也影响分化增殖以及器官形成等发育进 程。如烟草芽的形成以 28为最好，在 12以下或 33以上形成率最低。有的需要变温特殊 处理，如桃胚在 2条件进行一定时间的低温处理，有利于提高胚培养成活率。用 35处理草莓的茎尖分生组织3
