1、摘摘要要有机无机复合材料综合了有机材料和无机材料的优点，在力学、热学、光学、电磁学和生物学等方面具有许多优异性能，因此受到了各国科学家的广泛关注。本文以海藻酸钠为有机相，-氨丙基三乙氧基硅烷为无机相，利用两种不同的方法制备了两种不同的海藻酸钠/二氧化硅（SiO 2）复合材料，在此基础上，对这两种复合材料作为固定纤维素酶的载体进行了研究。本文主要包括以下三个部分：第一部分：共价交联海藻酸钠/SiO2 复合水凝胶的制备与表征利用多肽合成中的碳二亚胺法，以 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺（EDC）为活化剂活化海藻酸钠上的羧基，然后在常温下与偶联剂-氨丙基三乙氧基硅烷上的氨基反应生成酰胺
2、键而交联；同时，硅烷中的乙氧基发生水解缩聚反应得到了有机高分子和无机材料之间以共价键结合的杂化水凝胶。以 FTIR、 SEM 等实验方法对产物进行了表征,并探讨了杂化水凝胶的溶胀率、剪切模量、网链平均分子量与其结构之间的关系。结果表明，杂化材料中有机无机两相相容性良好，杂化材料的密度、溶涨率及其力学性能可以通过控制无机有机二者的比例加以控制。第二部分：共价交联海藻酸钠/SiO2 复合水凝胶固定化纤维素酶以第一部分的共价交联海藻酸钠/SiO2 复合水凝胶作为固定化纤维素酶载体，固定后，纤维素酶的包埋率超过了 86%，酶固定前后的SEM 图表明纤维素酶非常均匀地分布在载体中。探讨了 pH、温度对固
3、I摘 要定酶和游离酶活力的影响，研究了固定酶和游离酶的酶促反应动力学。结果表明固定酶具有对 pH 和温度更高的稳定性，固定酶的最适宜 pH 为 3.6，最佳催化温度为 50。固定酶的可重复实用性良好，连续使用 10 次后依然保留50%酶活力。第三部分：基于溶胶凝胶原理海藻酸钠/SiO2 复合载体固定化酶以- 氨丙基三乙氧基硅烷为前驱体，发生溶胶凝胶反应固定包埋海藻酸钠和纤维素酶。研究并比较了两种不同的复合材料固定酶的包埋率、米氏常数、对温度和 pH 的稳定性、储藏稳定性能以及可循环使用性能。研究结果表明，共价交联海藻酸钠/SiO2 复合水凝胶固定化纤维素酶具有更高的包埋率，更好的储藏稳定性能以
4、及可循环使用性能；而基于 SolGel 原理海藻酸钠/SiO2 复合载体固定化酶在固定酶的相对活力和对底物的亲和力方面则更胜一筹。关键词：海藻酸钠；复合材料；溶胶凝胶；纤维素酶IIAbstractAbstractIn this study, two kinds of hybrid composites were prepared usingsodium alginate as polymer moiety, silica as inorganic moiety. Both of thehybrid composites were studied as carriers for immobili
5、zation of cellulase.In detail, the thesis includes the following parts:Part: Fabrication and characterization of a novel covalentcross-linked alginate/SiO2 hybrid hydrogelThe first novel hybrid composite derived from3-aminopropyltrimethoxysilane and sodium alginate was preparedthrough covalent cross
6、-linking reaction accompanied with ahydrolysis/condensation single reaction in a reaction system (The hybridcomposites were designed as covalent cross-linking Alg-SiO2). Thecharacterization of covalent cross-linking Alg-SiO2 was employed byFT-IR ， SEM and EDS etc. The results revealed that cross-lin
7、kingreaction was carried out by NH2 and COO-.The shear modulus (G), themolecular weight between cross-links (Mc), and degree of swelling (Q)of the hydrogel were also investigated. The results of this study showedthat the proterties of hydrogel would be strong affected by its structure.Our work may b
8、e as a mean to generate hybrid hydrogels with a range ofmechanical properties.Part: Alginate/SiO 2 hybrid hydrogel for cellulose immobilizationIn order to reveal the potential applications of the novel hybridIIIAbstracthydrogel, the covalent cross-linking Alg-SiO2 hybrid hydrogel was usedas carriers
9、 for immobilization of cellulase. The loading efficiency ofimmobilized cellulase was up to 86% and the SEM photographs showedthat the cellulase was trapped in carriers homogeneously. The activities offree cellulase and immobilized cellulase were determined by measuringthe amount of glucose made from
10、 carboxymethyl cellulase in the givenconditions. The results showed that the immobilized cellulase had ahigher Km than free cellulase. The immobilized cellulase had betterstability with respect to pH or temperature than free cellulase and it alsoremained up to 50% activity after 10 cycles.Part: Immo
11、bilization of cellulase based on Sol- Gel process3-aminopropyltrimethoxysilane derived gel was incorporated intosodium alginate and enzyme solution, followed by Ca2+ cross-linking(Thehybrid composites were designed as Sol- Gel-derived Alg-SiO2). Theeffects of pH, temperature, MichaelisMenten constan
12、t (Km), storage andthermal stability on the two immobilized cellulases activity wereexamined. The covalent cross-linking Alg-SiO2 immobilized cellulasehad more loading efficiency (86%) than the Sol- Gel Alg-SiO2immobilized cellulase has (76%). It also had better performance andstorage stability. Com
13、pared to the covalent cross-linking Alg-SiO2immobilized cellulase, the Sol- Gel Alg-SiO2 immobilized cellulase hadbetter thermal stability and relative activity. For covalent cross-linkingIVAbstractAlg-SiO2 immobilized cellulase, MichaelisMenten constant (Km) valuewas 1.10 mg/ml, respectively, the s
14、ame value of Sol- Gel-derivedAlg-SiO2 immobilized cellulase was found to be 0.290 mg/ml.Keywords: sodium alginate; hybrid composites; Sol- Gel; cellulaseV原创性声明本人声明兹呈交的学位论文是本人在导师指导下完成的研究成果。论文写作中不包含其他人已经发表或撰写过的研究内容，如参考他人或集体的科研成果，均在论文中以明确的方式说明。本人依法享有和承担由此论文所产生的权利和责任。学位论文作者签名： 日期：学位论文版权使用授权声明本人同意授权华侨大学有
15、权保留并向国家机关或机构送交学位论文和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅。论文作者签名：签 名 日 期：指导教师签名：签 名 日 期：第一章 绪论第一章 绪 论1.1 有机无机杂化材料概述1.1.1 有机无机杂化材料材料、能源、信息与生命科学并列为现代科学技术的四大支柱，随着现代科技的发展，人类对材料提出了越来越高的要求。传统的单一材料已不能满足人们的要求，因此运用分子设计和分子工程进行多种材料的复合、组装和杂化，以实现材料之间的性能互补和优化已成为现代材料发展的趋势。1984 年，Schmidt1 等人首先提出了有机无机杂化材料（organicinorganichybrid composite）
16、的概念，杂化材料是指从分子水平上将两种或两种以上材料复合化，从而综合几种材料的优点以获得新型材料。有机无机杂化材料是一种均匀的多相材料，其中至少有一相的尺寸至少有一个维度在纳米数量级，纳米相与其它相间通过化学( 共价键、螯合键) 与物理(氢键等)作用或者互穿网络实现在纳米水平上复合，因而其结构和性能与具有较大微相尺寸的传统的复合材料相比有明显的区别。由于有机相和无机相间存在相互的作用力或形成了互穿网络，形成的结合微区的尺寸通常在纳米级甚至分子水平，使得两相之间的界面面积大，相互作用强，因此表现出一些独特性质，如尺寸效应、局域场效应、量子效应等。有机无机杂化材料综合了有机无机各自的优点，具有较高
17、的稳定性，在力学、热学、光学、电磁学和生物学等方面具有许多优异性能，因而成为材料学科研究的热点2。近些年，该研究已成为高分子化学与物理、物理化学和材料科学等多门学科交叉的前沿领域，受到各国科学家的重视。1.1.2 有机无机杂化材料的分类根据有机无机相间的相互作用的类型，有机无机杂化材料可分为三类3：（1）有机物分子或聚合物简单混合于无机基质中，此时有机/无机两相通过弱的次价力，如范德华力、氢键、静电作用或亲水疏水平衡相互连接。（2）无机组分和有机组分两相间存在强的化学键的杂化材料，包括共价键、离子键、配位键或离子-共价键。后者由于两相间存在化学键连接，故有效地抑制了宏观相分离而易得到纳米级分散
18、的杂化材料（3）在上述第一类和第二类杂化材料中加入掺杂物(有机的或无机的)时，掺杂组分嵌入有机无机杂化基质中得到此类杂化材料。1第一章 绪论1.1.3 有机无机杂化材料的制备方法有机无机杂化材料最初是通过溶胶-凝胶法制备的，经过科学工作者近二十年的不懈努力，这方面的研究开发工作取得了令人瞩目的成果，其合成方法得到了不断的完善。迄今为止，无机有机杂化材料的制备方法主要有以下几种：（1） 溶胶凝胶法。溶胶凝胶技术4是指用金属有机化合物、金属无机化合物或上述两种混合物经过水解缩聚过程，逐渐凝胶化及进行相应的后处理，而获得氧化物或其他化合物的一种方法，它是制备材料的湿化学方法中的一种。溶胶-凝胶反应通
19、常包括两个步骤5：一是烷氧基金属（或元素） M(OR)z，M=Si ，Ti，Zr，Al，Mo ，V，W ，Ce 等的水解；二是水解后的羟基化合物的缩合（缩聚）过程。以 Si(OR)4 为例，其溶胶凝胶反应过程可表示如下：水解过程：Si OR + H2OH+或 OH-Si OH + ROH缩合过程：H+或 OH-Si OH + HO Si Si O Si + H2O溶胶凝胶法可在室温或略高于室温的温和条件下引入有机小分子、低聚物或高聚物而最终获得具有精细结构的有机/无机杂化材料，在溶胶阶段各组分以分子形式分散，所以获得的杂化材料通常是纳米复合材料，具有其它传统复合材料所不具备的性质。此外，所合成
20、的材料还具有纯度高、组分计量比准确等特点。因此溶胶凝胶法是目前制取有机无机杂化材料最常用，也是较完善的方法。但是，溶胶凝胶法也存在着一些尚未完全解决的问题，其主要是在溶胶干燥过程中由于溶剂、小分子醇、水的挥发导致材料收缩龟裂。（2）插层法。许多无机化合物如硅酸类粘土、磷酸盐类、石墨、金属氧化物、二硫化物、三硫化磷络合物和氧氯化物等具有典型的层状结构6，通过在这些无机物中插入各种有机物可以用来制备高聚物/无机物层型杂化材料 7。插层法是利用层状无机物作为无机相，将有机物(高聚物或单体)作为另一相插入无机相的层间，制得无机/有机层状杂化材料的方法。这种层状结构的纳米杂化材料，无2第一章 绪论机相和
21、有机相的厚度只有 12nm，交错排列，层状无机物是一维方向上的纳米材料，粒子不易团聚，又易分散，不仅结构特征具有典型意义，而且在开发功能材料方面具有巨大的应用潜力。根据插层形式的不同，插层法又可以分为插层聚合、溶液插层、熔体插层等三种。（3）在位分散聚合法。在位分散聚合法是先使无机纳米粒子在聚合物单体中均匀分散，再引发单体聚合的方法。由于此法中，使用的无机纳米粒子很容易发生团聚，因此，在杂化前需对无机纳米粒子进行表面处理，即先将原生粒子或较小的团聚体稳定，阻止其再发生团聚。（4）共混法。共混法与聚合物中的共混改性相似，是将有机物与无机纳米粒子共混，该法是制备杂化材料最简单的方法，适合于各种形态
22、的纳米粒子。但在与有机物共混之前，必须对无机纳米粒子进行表面处理，以防止无机纳米粒子发生团聚。（5）自组装法。自组装的基本原理是根据体系自发地向自由能减少的方向移动的特点，利用具有亲水端和疏水端的两亲性分子在气-液界面上的定向生长性质，在有机相和无机相之间形成共价键、离子键和配位共价键，可用来制备由纳米微粒与超薄有机膜形成的多层交替有机/无机杂化材料 8。采用自组装技术制备的杂化材料具有有序结构，可以从分子水平上控制无机粒子的形状、尺寸、取向和结构，但是存在着操作流程和结构控制复杂等问题，这点上限制了它的广泛应用。（6）其它方法。有机无机杂化材料的制备除了以上四种方法，近年来还出现了很多其它特
23、殊的制备方法。比如 LB 膜技术9和电解聚合法10等。1.1.4 有机无机杂化材料的应用有机/无机复合杂化材料，经过几十年的发展，已显示出它的优异性能和巨大潜力。众多的合成方法和丰富的原料为实现该材料的设计提供广阔的空间，目前，有机无机杂化材料已经广泛应用于高性能工程塑料、催化材料、电致发光和光致变色材料、生物材料、半导体和导电材料、磁性材料、超导材料化学传感器等多方面11-17，涉及的产物形状有块体、薄膜、纤维、粉末和涂层等。3第一章 绪论1.2 海藻酸盐概述海藻酸盐（alginate ）是一种天然存在的高分子聚合物，由于它具有良好的生物降解性和生物相容性，因此在生物科技领域越来越受到人们的
24、关注。海藻酸盐最早被用于食品和饮料工业中，它可以作为增稠剂、稳定剂和胶凝剂18。而当海藻盐作为固定蛋白质、酶和细胞等生物大分子的载体时，又显示出一些独特的优点19：（ 1）凝胶网络保持含水的微环境，这有利于生物大分子的存活（2）用海藻酸包埋生物大分子条件温和，不需要有机溶剂（3）具有比较高的凝胶孔径，这有利于生物大分子的扩散（4）可以通过不同的涂层方法控制凝胶的孔径（5）在一般的生理条件下海藻酸可以分解和生物降解。1.2.1 海藻酸盐的来源和提取海藻酸盐是英国人 Standford20在 1881 年首次从狭叶海带（Laminariastenophylla）中加碱提取出来的，直到 1929 年
25、美国才正式开始工业化生产。我国在 1957 年开始生产海藻盐。近几十年来，海藻酸盐的生产发展特别迅速，在国际市场上占有重要地位。生产海藻酸盐的主要原料有巨藻、海带、极北海带、掌状海带、泡叶藻和昆布等褐藻类海洋植物。在这些褐藻类植物中，海藻酸盐是含量最多的多聚糖，它可以占到这些褐藻干重的 40。海藻酸盐中含有 Ba2+、Ca2+ 、Mg 2+、Sr 2+、Na +等多种金属阳离子，海藻酸钠是最普通的一种21。目前世界范围内提取海藻酸钠可分为四种工艺22，分别为酸凝酸化法、钙凝酸化法、钙凝离子交换法、酶解提取法，目前国内绝大部分厂家采用钙凝酸化法。1.2.2 海藻酸钠的结构海藻酸钠分子式为（C6
26、H7O6Na）n ，不同产地和季节提取出来的海藻酸钠的分子量不一样，它的分子量一般在 32000-200000 之间。它含有两个结构单元23，为-D-甘露糖醛酸（M 单元）和 -L-古洛糖醛酸（G 单元）无规链接的共聚物（如图 1.1 所示）。4第一章 绪论COONa HH O H OHOH OHO COONaOH OH OH HH H H H n-D-甘露糖醛酸 (M单元 ) -L-古洛糖醛酸 (G单元 )图 1.1 海藻酸结构图Figure1.1 Structure of sodium alginate这两种单元的原始差别仅在于 C5 上的羟基位置不同，成环后的构象不同，而进一步聚合成长链
27、后空间结构差别则非常大。在整个海藻酸钠大分子中，G 单元和 M 单元是通过 C1 和 C4 连接的，分子长链上没有分支和侧链，它是通过下面三种不同的块嵌合而成的：M-M-M-M-M-MG-G-G-G-G-GM-G-M-G-M-G聚甘露糖醛酸聚古洛糖醛酸交替块1.2.3 海藻酸盐的性质海藻酸盐的性质和它的分子量、G 和 M 单元的比例、三种块的比例变化密切相关24。三种不同的块中，其弹性变化顺序为：MGMMGG。一般来说，G 单元含量高的海藻酸盐制得的凝胶较硬和较脆，凝胶孔径也较大，对一价的金属离子的稳定性也较高；而 M 单元含量高的凝胶弹性则较好。当海藻酸盐的分子量大于2.4105 时，它的强
28、度则主要由分子量控制，分子量越大，强度越高；而对于低分子量的海藻酸盐则有一个临界点25，在这临界点以下，强度随分子量的增大而减小。1.2.3.1 凝胶性能海藻酸钠很容易与某些二价阳离子键合形成水凝胶, 它是典型的离子交联水凝胶26，凝胶的温度可以在 0-100之间。在海藻酸钠水溶液中加入 Ca2+ 、Sr2+ 、Ba 2+、 Pb2+ 、Cu2+ 、Cd2+ 、Co2+ 、Ni2+ 、Zn2+ 、Mn 2 +等阳离子后, G单元上的 Na + 与二价离子发生离子交换反应, G 基团堆积而形成交联网络结构（蛋箱结构27）, 从而转变成水凝胶。海藻酸和二价阳离子形成凝胶方法简单易于操作，但是这种方
29、法得到的离子5第一章 绪论交联型海藻酸盐水凝胶却由于二价阳离子的流失而解体, 这一过程通常是不可控和不可预测的28。Ca 2 + 易和 EDTA、乳酸、磷酸、柠檬酸等发生螯合反应而脱离凝胶网络造成凝胶解体；在含有高浓度 Na+ 、 Mg2 + 的溶液中也会发生离子交换反应而使海藻酸盐凝胶网络解体, 导致凝胶性能的不稳定。因此，可以通过不同类型的交联剂使海藻酸共价交联，以精确控制凝胶的力学性能和溶涨性能。常见的交联剂有己二酰二肼、L-赖氨酸、聚乙二醇-二胺 29，研究表明，海藻酸凝胶的降解性能以及力学性能可以通过交联密度控制。此外，加入过碘酸钠使海藻酸轻度氧化得到的凝胶在水溶液中也可以降解，降解
30、速率由水中的 PH 值和温度所控制30。海藻酸钠凝胶还可以通过添加聚阳离子31 (如壳聚糖、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺等) 与海藻酸钠形成强聚电解质结构而形成凝胶。这种结构即使在 Ca2+ 螯合剂存在下也不会解体, 能够稳定凝胶的性能。1.2.3.2 多孔性和生物大分子的扩散生物大分子在海藻酸盐凝胶中的释放主要有两种形式，一个是通过凝胶网络中的孔洞扩散，另一个是通过海藻酸盐分子链的降解。电子显微镜表明，海藻酸钙表面的孔径为 5200nm32，而 L Klein33 测得海藻酸钙凝胶内部的孔径为1216nm，显然海藻酸钙凝胶内部比表面网络分布要紧密结实得多。葡萄糖和水等小分子可以在海藻酸盐凝胶中自由扩
31、散，而对于蛋白质、酶及其它生物大分子在凝胶中的扩散则要受到它们本身的分子量大小和凝胶结构的控制24。高含量 G 单元制得的凝胶收缩较小孔径较大，大分子扩散速度较 M 单元含量高的凝胶大。将海藻酸盐凝胶部分干燥后其孔径也会发生巨大的变化34，把部分干燥的海藻酸盐凝胶重新在水中溶胀，海藻酸盐的质量分数比未干燥处理的海藻酸盐水凝胶来得大，孔径变小；而完全脱水的海藻酸盐凝胶表面会破裂，重新溶胀于水中会加速凝胶网络的解体使大分子的扩散变快35。当将海藻酸盐置于 pH7.5 时就失去了反应活性。因此，pH 的控制对于本实验起着至关重要的作用。本实验用 MES控制缓冲液 pH 为 5，由于 KH-550 在
32、水溶液中为碱性，加入进行偶联反应时会使pH 迅速升高超过 7.5；此外如果直接加入 KH-550 会因为交联太快使凝胶不均匀，因此选择把 KH-550 配成 12（v/v）的盐酸溶液（pH4）。21第二章 海藻酸钠/SiO2 共价交联复合水凝胶的制备及其结构表征肽键合成反应原理如图 2.1 所示。羧酸和碳化二亚胺在酸性条件下反应生成中间体 O-酰基脲和 O-酰基异脲，O- 酰基脲再进一步和含胺基的物质发生反应而生成肽键。而如果是在碱的催化下，将发生 ON 重排生成副产物 N-乙酰基脲，它不再进一步氨解而得不到肽键。为了抑制或减少 N-乙酰基脲的形成本实验加入了辅助试剂 NHS，形成活性较低的活
33、泼酯，但乃足于进行快速的肽键合成，其反应原理参见图 2.2。R1OO- +NCNR3R2H+R1OHNONR3H+-H+R1OHNONHR3R2（ O-酰基脲 )R2(O-酰基异脲 )副反应： O N重排OH- H+R4 NH2R2R1NHNOOR3R1HNOR4+HNHNR2OR3（ N-乙酰基脲） （肽） （脲衍生物）图 2.1 肽键合成原理OR1 N OHOHNONR2R3O(NHS) OON OOR1R4 NH2R1HNOR4+OON OH图 2.2 肽键合成原理 222第二章 海藻酸钠/SiO2 共价交联复合水凝胶的制备及其结构表征2.3.2 凝胶点分析表 2.1：不同温度对凝胶点的
34、影响温度 T/凝胶时间 t/min2233252536144010表 2.1 为相同偶联剂 KH-550 含量和浓度条件下反应温度对凝胶时间的影响。从表中可以得知，凝胶点受时间影响较大，温度越高，交联速率越高，凝胶时间越短。表 2.2：不同浓度的偶联剂 KH-550 盐酸溶液对凝胶点的影响（T=25）KH-550 盐酸溶液浓度（ v/v） 6% 12% 25% 50%凝胶时间 t/min 37 25 13 迅速表 2.2 为相同温度相同偶联剂量不同偶联剂盐酸溶液浓度对凝胶的影响。显然随着偶联剂浓度的增加，由于单位体积中可参与反应的氨基浓度的增大，凝胶时间大大缩短。但是当浓度大于 25时，凝胶交
35、联的不均匀，而当浓度为 50，由于交联过于迅速使凝胶的形成很不均匀，造成局部结块表 2.3：不同偶联剂 KH-550 含量对凝胶点的影响(T=25)KH-550/COO-凝胶时间 t/min1:4301:2251:1.5231:120表 2.3 为相同温度相同偶联剂盐酸溶液浓度不同偶联剂量对凝胶点的影响。从表中可看出，随着偶联剂含量的增加，凝胶时间缩短，但是其所受的影响较温度和偶联剂浓度不显著。2.3.3 DTA-TG 分析23TemperatureDifference/ F mg-1Weight/ %TemperatureDifference/ Fmg-1Weight/ %（第二章 海藻酸钠
36、/SiO2 共价交联复合水凝胶的制备及其结构表征420TG1008060-2-4DTA 4020200 400 600 800Temperature /C图 2.3：海藻酸钠的 DTA-TG 图Fig2.3 DTA and TG curves for sodium alginate图 2.3 海藻酸钠的 DTA-TG 图。从图中可以看出，海藻酸钠的热分解分为几个部分78-79： 1）第一步发生在 100左右，对应热重上有 17.3的失重，这是由于海藻酸钠里自由水的失去。（2）海藻酸钠的第二步热分解发生在 220280之间, 热重曲线上有一 32% 的快速失重,对应的 DSC 曲线出现一尖锐的放
37、热峰。该过程为海藻酸钠裂解为较为稳定的中间产物, 对应着海藻酸钠骨架的断裂,相邻羟基以水分子的形式脱去。 3）第三步发生在 320400之间，DTA 上有一个较平坦的放热峰，其 TG 上对应着一较为缓慢的失重（6），这是由于中间产物进一步分解, 并脱羧放出 CO2, 产物部分碳化。（4）第四步发生在在 560左右，DTA 曲线上有一发热峰，对应的 TG 上有 5左右的缓慢失重，这是由于海藻酸钠的碳化物进一步氧化分解, 而最终反应生成 Na2O。4TG10020DTA806040-220-40200 400 600 800 1000Temperature /C图 2.4：海藻酸钠/SiO2 的 DTA-TG 图Fig2.4 DTA and TG curves for hybird hydrogel24
